Die Rolle von Crb3 in epithelialer Morphogenese:
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Münster
2022
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|---|---|
| adam_text | INHALT
1
EINLEITUNG
........................................................................................................................................
1
1.1.
NIERENZYSTENERKRANKUNG
..........................................................................................................
1
1.1.1.
ZILIOPATHIEN
PRIMAERER
ZILIEN
..............................................................................................
1
1.1.2.
POLARITAET
DER
ZELLE,
TIGHT
JUNCTIONS
...................................................................................
2
1.2.
DAS
PROTEIN
CRB3......................................................................................................................
3
1.2.1.
CRB-KOMPLEX
UND
BINDUNGSPARTNER
..................................................................................
3
1.2.2.
AUFBAU
UND
VORKOMMEN
..................................................................................................
4
1.2.3.
WIRKUNG
............................................................................................................................
6
1.3.
ZIELSETZUNG................................................................................................................................
7
2
MATERIALIEN
.......................................................................................................................................
9
2.1.
GERAETE
......................................................................................................................................
9
2.2.
LABORBEDARF
............................................................................................................................
12
2.3.
CHEMIKALIEN
............................................................................................................................
15
2.4.
PUFFER,
MEDIEN,
LOESUNGEN
......................................................................................................
18
2.5.
ENZYME
UND
PUFFER
.................................................................................................................
20
2.6.
PRIMER
.....................................................................................................................................
21
2.7.
PLASMIDE
UND
VEKTOREN
..........................................................................................................
22
2.8.
PRIMAERE
ANTIKOERPER
.................................................................................................................
23
2.9.
SEKUNDAERE
ANTIKOERPER
............................................................................................................
24
2.10.
BAKTERIEN
.............................................................................................................................
26
2.11.
EUKARYONTISCHE
ZELLLINIEN
......................................................................................................
26
2.12.
KOMMERZIELLE
KITS
................................................................................................................
27
2.13.
SOFTWARE
.............................................................................................................................
27
3
METHODEN
......................................................................................................................................
29
3.1.
METHODEN
DER
ZELLKULTUR
.......................................................................................................
29
3.1.1.
KULTIVIERUNG
VON
EUKARYOTISCHEN
ZELLEN
........................................................................
29
3.1.2.
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
................................................................................................
29
3.1.3.
GENERIERUNG
VON
STABILEN
ZELLLINIEN
MITTELS
CRISPR-CAS9
.............................................
30
3.1.4.
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
EUKARYOTISCHER
ZELLEN
.............................................................
33
3.2.
PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN
...........................................................................................
33
3.2.1.
IMMUNFLUORESZENZ
ODER
ANTIKOERPERFAERBUNG
..................................................................
33
3.2.2.
PROTEINGEWINNUNG
VON
EUKARYOTISCHEN
ZELLEN
(=LYSAT-HERSTELLUNG)
..............................
35
3.2.3.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.......................................................
36
3.2.4.
WESTERN
BLOT
...................................................................................................................
37
3.3.
MIKROBIOLOGISCHE
METHODEN
.................................................................................................
38
3.3.1.
TRANSFORMATION
VON
KOMPETENTEN
BAKTERIEN
................................................................
38
3.3.2.
PLASMID-DNA
ISOLIERUNG
AUS
BAKTERIEN
...........................................................................
38
3.4.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
..........................................................................................
39
3.4.1.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEURE
...............................................................
39
3.4.2.
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
UND
DNA-AUFREINIGUNG
AUS
AGAROSEGEL
................................
39
3.4.3.
ENZYMATISCHE
RESTRIKTION
VON
DNA
.................................................................................
40
3.4.4.
LIGATION
............................................................................................................................
40
3.4.5.
KLONIERUNG
VON
DNA
........................................................................................................
41
3.4.6.
SEQUENZIERUNG
................................................................................................................
41
3.4.7.
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
....................................................................................
42
4
ERGEBNISSE
.....................................................................................................................................
43
4.1.
WERKZEUGE
ZUR
UNTERSUCHUNG
DES
PROTEINS
CRB3
.................................................................
43
4.1.1.
VALIDIERUNG
VON
ANTIKOERPERN
..........................................................................................
43
4.1.2.
GENERIERUNG
EINER
CRB3-DEFIZITAEREN
ZELLLINIE
..................................................................
48
4.2.
VERHALTEN
VON
CRB3-DEFIZITAEREN
ZELLEN
..................................................................................
50
4.2.1.
IMMUNFLUORESZENZ-BILDER
IN
2D-KULTUR
............................................................................
50
4.2.2.
IMMUNFLUORESZENZ-BILDER
IN
3D-KULTUR
............................................................................
52
4.3.
ZUSAMMENWIRKEN
DES
PROTEINKOMPLEXES
PALSL-PATJ-CRB3
..................................................
53
4.3.1.
REKRUTIERUNG
VON
PALSL
UND
PATJ
...................................................................................
53
4.3.2.
GENERIEREN
EINER
PATJ
KNOCK-OUT
ZELLLINIE
....................................................................
57
5
DISKUSSION
......................................................................................................................................
59
DER
PROTEINKOMPLEX
PAR
...............................................................................................................
61
ANTAGONISTEN
VON
CRUMBS
.............................................................................................................
62
DIE
KOMPLEX-PARTNER
PATJ
UND
PALSL
............................................................................................
63
FEHLERQUELLEN
.................................................................................................................................
64
ZELLLINIE
..........................................................................................................................................
64
AUSBLICK
.........................................................................................................................................
65
LITERATURVERZEICHNIS
...............................................................................................................................
66
DANKSAGUNG
...........................................................................................................................................
81
LEBENSLAUF
.............................................................................................................................................
82
|
| adam_txt |
INHALT
1
EINLEITUNG
.
1
1.1.
NIERENZYSTENERKRANKUNG
.
1
1.1.1.
ZILIOPATHIEN
PRIMAERER
ZILIEN
.
1
1.1.2.
POLARITAET
DER
ZELLE,
TIGHT
JUNCTIONS
.
2
1.2.
DAS
PROTEIN
CRB3.
3
1.2.1.
CRB-KOMPLEX
UND
BINDUNGSPARTNER
.
3
1.2.2.
AUFBAU
UND
VORKOMMEN
.
4
1.2.3.
WIRKUNG
.
6
1.3.
ZIELSETZUNG.
7
2
MATERIALIEN
.
9
2.1.
GERAETE
.
9
2.2.
LABORBEDARF
.
12
2.3.
CHEMIKALIEN
.
15
2.4.
PUFFER,
MEDIEN,
LOESUNGEN
.
18
2.5.
ENZYME
UND
PUFFER
.
20
2.6.
PRIMER
.
21
2.7.
PLASMIDE
UND
VEKTOREN
.
22
2.8.
PRIMAERE
ANTIKOERPER
.
23
2.9.
SEKUNDAERE
ANTIKOERPER
.
24
2.10.
BAKTERIEN
.
26
2.11.
EUKARYONTISCHE
ZELLLINIEN
.
26
2.12.
KOMMERZIELLE
KITS
.
27
2.13.
SOFTWARE
.
27
3
METHODEN
.
29
3.1.
METHODEN
DER
ZELLKULTUR
.
29
3.1.1.
KULTIVIERUNG
VON
EUKARYOTISCHEN
ZELLEN
.
29
3.1.2.
TRANSIENTE
TRANSFEKTION
.
29
3.1.3.
GENERIERUNG
VON
STABILEN
ZELLLINIEN
MITTELS
CRISPR-CAS9
.
30
3.1.4.
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
EUKARYOTISCHER
ZELLEN
.
33
3.2.
PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN
.
33
3.2.1.
IMMUNFLUORESZENZ
ODER
ANTIKOERPERFAERBUNG
.
33
3.2.2.
PROTEINGEWINNUNG
VON
EUKARYOTISCHEN
ZELLEN
(=LYSAT-HERSTELLUNG)
.
35
3.2.3.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
36
3.2.4.
WESTERN
BLOT
.
37
3.3.
MIKROBIOLOGISCHE
METHODEN
.
38
3.3.1.
TRANSFORMATION
VON
KOMPETENTEN
BAKTERIEN
.
38
3.3.2.
PLASMID-DNA
ISOLIERUNG
AUS
BAKTERIEN
.
38
3.4.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
39
3.4.1.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEURE
.
39
3.4.2.
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
UND
DNA-AUFREINIGUNG
AUS
AGAROSEGEL
.
39
3.4.3.
ENZYMATISCHE
RESTRIKTION
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DNA
.
40
3.4.4.
LIGATION
.
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3.4.5.
KLONIERUNG
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DNA
.
41
3.4.6.
SEQUENZIERUNG
.
41
3.4.7.
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
.
42
4
ERGEBNISSE
.
43
4.1.
WERKZEUGE
ZUR
UNTERSUCHUNG
DES
PROTEINS
CRB3
.
43
4.1.1.
VALIDIERUNG
VON
ANTIKOERPERN
.
43
4.1.2.
GENERIERUNG
EINER
CRB3-DEFIZITAEREN
ZELLLINIE
.
48
4.2.
VERHALTEN
VON
CRB3-DEFIZITAEREN
ZELLEN
.
50
4.2.1.
IMMUNFLUORESZENZ-BILDER
IN
2D-KULTUR
.
50
4.2.2.
IMMUNFLUORESZENZ-BILDER
IN
3D-KULTUR
.
52
4.3.
ZUSAMMENWIRKEN
DES
PROTEINKOMPLEXES
PALSL-PATJ-CRB3
.
53
4.3.1.
REKRUTIERUNG
VON
PALSL
UND
PATJ
.
53
4.3.2.
GENERIEREN
EINER
PATJ
KNOCK-OUT
ZELLLINIE
.
57
5
DISKUSSION
.
59
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PROTEINKOMPLEX
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.
61
ANTAGONISTEN
VON
CRUMBS
.
62
DIE
KOMPLEX-PARTNER
PATJ
UND
PALSL
.
63
FEHLERQUELLEN
.
64
ZELLLINIE
.
64
AUSBLICK
.
65
LITERATURVERZEICHNIS
.
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.
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.
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