Verfügbarkeit: Analyse der kleinen RNA s479 in Haloferax volcanii und die Untersuchung des HRAMP Systems in Halorubrum Iacusprofundi

Analyse der kleinen RNA s479 in Haloferax volcanii und die Untersuchung des HRAMP Systems in Halorubrum Iacusprofundi:

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Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser:	Märkle, Pascal 1993- (VerfasserIn)
Format:	Abschlussarbeit Buch
Sprache:	German
Veröffentlicht:	Ulm März 2022
Schlagworte:	Haloferax volcanii RNS Hochschulschrift
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Beschreibung:	V, 201 Blätter Illustrationen, Diagramme 30 cm

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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS ............................................................................................................................... II 1. EINLEITUNG .................................................................................................................................... 1 1.1. ARCHAEA - EINE DOMAENE DES LEBENS ............................................................................... 1 1.2. HALOARCHAEEN - DIE ZWEI VERTRETER HALOFERAX VOLCANII UND HALORUBRUM LACUSPROFUNDI .............................................................................................................................................. 4 DER HALOARCHAEALE MODELLORGANISMUS H. VOLCANII ................................................................. 5 DAS HALOARCHAEON HALORUBRUM LACUSPROFUNDI ....................................................................... 7 1.3. DAS CRISPR-CAS SYSTEM DER PROKARYOTEN .................................................................... 8 DIE DREI PHASEN DER IMMUNANTWORT ....................................................................................... 11 ADAPTATIONSPHASE .................................................................................................................... 12 EXPRESSIONSPHASE .................................................................................................................. 13 INTERFERENZPHASE ...................................................................................................................... 14 1.4. DAS CRISPR-CAS SYSTEM VON H. VOLCANII ..................................................................... 15 1.5. DIE KLEINE RNA 479 UND IHRE NAEHE ZUM CRISPR-CAS SYSTEM ................................... 16 1.6. DAS HRAMP SYSTEM VON H. LACUSPROFUNDI .................................................................... 19 1.7. ZIELSETZUNG DER ARBEIT ...................................................................................................... 22 2. MATERIAL ..................................................................................................................................... 24 2.1. CHEMIKALIEN, REAGENZIEN UND KITS ................................................................................. 24 2.2. ENZYME UND GROESSENSTANDARDS ........................................................................................ 25 2.3. ANTIKOERPER ........................................................................................................................... 26 2.4. NUKLEOTIDE .......................................................................................................................... 27 2.5. VEKTOREN UND PLASMIDE .................................................................................................... 29 2.6. STAEMME ............................................................................................................................... 30 2.7. NAEHRMEDIEN ........................................................................................................................ 33 2.8. PUFFER UND LOESUNGEN ........................................................................................................ 40 2.9. VERBRAUCHSMATERIALIEN ..................................................................................................... 51 2.10. AUSSTATTUNG UND GERAETE .............................................................................................. 52 2.11. SOFTWARE ........................................................................................................................57 3. METHODEN .................................................................................................................................58 3.1. STANDARDMETHODEN ...........................................................................................................58 3.2. HERSTELLUNG VON -80 C RUECKLAGEN ................................................................................. 59 3.2.1 . ANFERTIGUNG VON RUECKLAGEN AUS E. ..................................................................59 3.2.2 ANFERTIGUNG VON RUECKLAGEN AUS H. VOLCANII UND H. IACUSPROFUNDI-KU TUREN .......... 59 3.3. ERSTELLEN EINER WACHSTUMSKURVE .....................................................................................59 3.4. ISOLATION VON DNA AUS AGAROSEGELEN ............................................................................. 60 3.5. TRANSFORMATION VON H. VOLCANII ....................................................................................... 60 3.6. TRANSFORMATION VON H. LACUSPROFUNDI .............................................................................. 61 3.7. HERSTELLUNG VON DELETIONSSTAEMMEN ................................................................................ 62 3.8. ISOLATION GENOMISCHER DNA AUS H. VOLCANII ................................................................... 63 3.9. DURCHFUEHRUNG EINER SOUTHERN-BLOT-ANALYSE ................................................................... 64 3.10. RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON PCR-PRODUKTEN UND OLIGONUKLEOTIDEN ....................... 65 3.11. HYBRIDISIERUNG MIT RADIOAKTIV MARKIERTEN SONDEN ..................................................... 66 3.12. ISOLATION VON RNA AUS H. VOLCANII UND H. LACUSPROFUNDI ..........................................67 3.12.1. RNA FUER TRANSKRIPTOMANALYSEN ......................................................................... 69 3.12.2. ISOLATION VON RNA AUS ELUTIONSFRAKTIONEN ......................................................... 69 3.13. DURCHFUEHRUNG EINER NORTHERN-BLOT-ANALYSE ............................................................. 69 3.13.1. NORTHERN BLOT FUER RNAS KUERZER ALS 300 NUKLEOTIDE IM POLYACRYLAMIDGEL ......... 70 3.13.2. NORTHERN BLOT FUER RNAS LAENGER ALS 300 NUKLEOTIDE IM AGAROSEGEL ................. 71 3.14. RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON RNA MIT [5 32 P]-PCP ................................................... 72 3.15. ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ASSAYS ......................................................................... 73 3.16. PROTEINAUFSCHLUSS (FUER FLAG-AUFREINIGUNG) ............................................................... 74 3.16.1. ISOLATION VON MEMBRANPROTEINEN ......................................................................... 74 3.17. FLAG-AUFREINIGUNG ....................................................................................................... 75 3.18. GELELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG UND WESTERN BLOT ............................................. 76 3.18.1. COOMASSIE-FAERBUNG ............................................................................................. 77 3.18.2. SILBERFAERBUNG .........................................................................................................77 III 3.18.3. ANTIKOERPER-DETEKTION ............................................................................................ 78 3.19. FRAKTIONIERUNG VON PROTEINEN DURCH GELFILTRATION ....................................................78 3.19.1. ANALYSE MITTELS SUPERDEXYY 200 INCREASE 10/300 GL ..................................... 79 3.20. MASSENSPEKTROMETRIE ................................................................................................... 79 3.21. RNA INTERACTION BY LIGATION AND SEQUENCING (RILSEQ) ............................................. 80 4. ERGEBNISSE .............................................................................................................................. 81 4.1. DIE SRNA 479 UND DAS CRISPR-CAS SYSTEM IN HALOFERAX VOLCANII .......................... 81 4.1.1. ANALYSE DER LOKALISATION UND TRANSKRIPTLAENGE DER S479 ....................................... 81 4.1.2. PHAENOTYP UNTERSUCHUNG MITTELS LICHTMIKROSKOPIE ................................................ 83 4.1.4. VERGLEICHENDE TRANSKRIPTOMANALYSE DES AS479::TRPA UND H66 WILDTYPSTAMMES .................................................................................................................................... 86 4.1.5. VERGLEICHENDE PROTEOMANALYSE DES S479::TRPA STAMMES UND H66 WILDTYPS ..87 4.1.6. EXPERIMENTELLE UNTERSUCHUNG DER ZNU-EXPRESSION VIA LANGE NORTHERN BLOT ANALYSE ....................................................................................................................................90 4.1.7. UNTERSUCHUNG DER POTENZIELLEN INTERAKTION DER S479 MIT DEM ZNU-OPERON ........93 4.2. ISOLATION WEITERER POTENZIELLER KLEINER RNAS AUS DEM CASCADE-KOMPLEX ...............98 4.2.1. AUFREINIGUNG DES CASCADE-KOMPLEXES UEBER CAS7N-FLAG .................................98 4.2.2. UNTERSUCHUNG VON POTENZIELLEN RNA-RNA INTERAKTIONEN MITTELS RILSEQ ......... 100 4.2.3. GELFILTRATION VON CAS7N-FLAG ELUATEN ZUR ISOLIERUNG DES CASCADE-KOMPLEXES. .................................................................................................................................. 100 4.2.4. UNTERSUCHUNG DER GEIFILTRATIONSFRAKTIONEN DURCH SILBERFAERBUNG UND WESTERN BLOT ANALYSE .................................................................................................................................. 104 4.2.5. UNTERSUCHUNG DER AUS DEN FRAKTIONEN GEWONNENEN RNA ................................. 106 4.2.6. SEQUENZIERUNG DER AUS DEM CASCADE-KOMPLEX ISOLIERTEN RNA .....................108 4.2.7. AUSWERTUNG DER RNA SEQUENZIERUNG ..................................................................109 4.3. DIE UNTERSUCHUNG DES HRAMP-SYSTEMS IN HALORUBRUM LACUSPROFUNDI ................. 112 4.3.1. HERSTELLUNG VON EINZELNEN UEBEREXPRESSIONSPLASMIDE ZUR ANALYSE DER EINZELNEN HRAMP-PROTEINE .................................................................................................................. 112 4.3.2. MASSENSPEKTROMETRIE DER HRAMP-N-FLAG FUSIONSPROTEINE .......................... 115 4.3.3. TRANSKRIPTOMANALYSE DES HL1 WILDTYPS .............................................................. 117 IV 4.3.4. KOENNEN CAS7LIKE UND CASOELIKE RNA BINDEN? .....................................................118 4.3.5. KLONIERUNG DES EXPRESSIONSVEKTORS PWL-NOV-P.FDX-HRAMPGES-N-FLAG-T.SYN. .................................................................................................................................. 120 4.3.6. COOMASSIE UND WESTERN BLOT ANALYSE DES UEBEREXPRIMIERTEN HRAMP GESAMTKONSTRUKTS .................................................................................................................. 121 4.3.7. UNTERSUCHUNG DES POTENZIELLEN HRAMP KOMPLEXES VIA GELFILTRATION ............... 122 5. DISKUSSION ............................................................................................................................... 126 5.1. DIE UNTERSUCHUNG DER KLEINEN RNA 479 ....................................................................... 126 5.2. DIE UNTERSUCHUNG GEBUNDENER RNAS AUS DEM CASCADE-KOMPLEX .......................... 131 5.3. DIE UNTERSUCHUNG DES HRAMP SYSTEMS IN H. LACUSPROFUNDI ................................... 136 6. ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................................ 141 7. SUMMARY ................................................................................................................................. 142 8. ANHANG .................................................................................................................................... 143 8.1. QUELLENVERZEICHNIS .......................................................................................................... 143 8.2. ABBILDUNGSVERZEICHNIS .................................................................................................... 158 8.3. TABELLENVERZEICHNIS ......................................................................................................... 160 8.4. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS .................................................................................................. 161 8.5. ROH-DATEN TABELLEN DES WACHSTUMSVERSUCHS AS479::TRPA UND H66 WILDTYP ........165 8.6. BERECHNUNG DER WACHSTUMSKURVEN .............................................................................. 174 8.7. ERGEBNISSE DER MASSENSPEKTROMETRIE DES AS479::TRPA STAMMES ............................. 175 8.8. TABELLE DER AUS DEM CASCADE-KOMPLEX ISOLIERTEN RNAS ........................................... 181 8.9. IN DIESER ARBEIT GENERIERTEN STAEMME UND VEKTOREN .................................................... 193 8.10. BEITRAEGE ZU DIESER ARBEIT ........................................................................................... 195 CURRICULUM VITAE ............................................................................................................................ 196 PUBLIKATIONSLISTE ............................................................................................................................. 197 DANKSAGUNG ................................................................................................................................... 199 ERKLAERUNG UEBER IN ANSPRUCH GENOMMENE HILFEN ......................................................................... 201 V
adam_txt	INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS . II 1. EINLEITUNG . 1 1.1. ARCHAEA - EINE DOMAENE DES LEBENS . 1 1.2. HALOARCHAEEN - DIE ZWEI VERTRETER HALOFERAX VOLCANII UND HALORUBRUM LACUSPROFUNDI . 4 DER HALOARCHAEALE MODELLORGANISMUS H. VOLCANII . 5 DAS HALOARCHAEON HALORUBRUM LACUSPROFUNDI . 7 1.3. DAS CRISPR-CAS SYSTEM DER PROKARYOTEN . 8 DIE DREI PHASEN DER IMMUNANTWORT . 11 ADAPTATIONSPHASE . 12 EXPRESSIONSPHASE . 13 INTERFERENZPHASE . 14 1.4. DAS CRISPR-CAS SYSTEM VON H. VOLCANII . 15 1.5. DIE KLEINE RNA 479 UND IHRE NAEHE ZUM CRISPR-CAS SYSTEM . 16 1.6. DAS HRAMP SYSTEM VON H. LACUSPROFUNDI . 19 1.7. ZIELSETZUNG DER ARBEIT . 22 2. MATERIAL . 24 2.1. CHEMIKALIEN, REAGENZIEN UND KITS . 24 2.2. ENZYME UND GROESSENSTANDARDS . 25 2.3. ANTIKOERPER . 26 2.4. NUKLEOTIDE . 27 2.5. VEKTOREN UND PLASMIDE . 29 2.6. STAEMME . 30 2.7. NAEHRMEDIEN . 33 2.8. PUFFER UND LOESUNGEN . 40 2.9. VERBRAUCHSMATERIALIEN . 51 2.10. AUSSTATTUNG UND GERAETE . 52 2.11. SOFTWARE .57 3. METHODEN .58 3.1. STANDARDMETHODEN .58 3.2. HERSTELLUNG VON -80 C RUECKLAGEN . 59 3.2.1 . ANFERTIGUNG VON RUECKLAGEN AUS E. .59 3.2.2 ANFERTIGUNG VON RUECKLAGEN AUS H. VOLCANII UND H. IACUSPROFUNDI-KU\TUREN . 59 3.3. ERSTELLEN EINER WACHSTUMSKURVE .59 3.4. ISOLATION VON DNA AUS AGAROSEGELEN . 60 3.5. TRANSFORMATION VON H. VOLCANII . 60 3.6. TRANSFORMATION VON H. LACUSPROFUNDI . 61 3.7. HERSTELLUNG VON DELETIONSSTAEMMEN . 62 3.8. ISOLATION GENOMISCHER DNA AUS H. VOLCANII . 63 3.9. DURCHFUEHRUNG EINER SOUTHERN-BLOT-ANALYSE . 64 3.10. RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON PCR-PRODUKTEN UND OLIGONUKLEOTIDEN . 65 3.11. HYBRIDISIERUNG MIT RADIOAKTIV MARKIERTEN SONDEN . 66 3.12. ISOLATION VON RNA AUS H. VOLCANII UND H. LACUSPROFUNDI .67 3.12.1. RNA FUER TRANSKRIPTOMANALYSEN . 69 3.12.2. ISOLATION VON RNA AUS ELUTIONSFRAKTIONEN . 69 3.13. DURCHFUEHRUNG EINER NORTHERN-BLOT-ANALYSE . 69 3.13.1. NORTHERN BLOT FUER RNAS KUERZER ALS 300 NUKLEOTIDE IM POLYACRYLAMIDGEL . 70 3.13.2. NORTHERN BLOT FUER RNAS LAENGER ALS 300 NUKLEOTIDE IM AGAROSEGEL . 71 3.14. RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON RNA MIT [5' 32 P]-PCP . 72 3.15. ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ASSAYS . 73 3.16. PROTEINAUFSCHLUSS (FUER FLAG-AUFREINIGUNG) . 74 3.16.1. ISOLATION VON MEMBRANPROTEINEN . 74 3.17. FLAG-AUFREINIGUNG . 75 3.18. GELELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG UND WESTERN BLOT . 76 3.18.1. COOMASSIE-FAERBUNG . 77 3.18.2. SILBERFAERBUNG .77 III 3.18.3. ANTIKOERPER-DETEKTION . 78 3.19. FRAKTIONIERUNG VON PROTEINEN DURCH GELFILTRATION .78 3.19.1. ANALYSE MITTELS SUPERDEXYY 200 INCREASE 10/300 GL . 79 3.20. MASSENSPEKTROMETRIE . 79 3.21. RNA INTERACTION BY LIGATION AND SEQUENCING (RILSEQ) . 80 4. ERGEBNISSE . 81 4.1. DIE SRNA 479 UND DAS CRISPR-CAS SYSTEM IN HALOFERAX VOLCANII . 81 4.1.1. ANALYSE DER LOKALISATION UND TRANSKRIPTLAENGE DER S479 . 81 4.1.2. PHAENOTYP UNTERSUCHUNG MITTELS LICHTMIKROSKOPIE . 83 4.1.4. VERGLEICHENDE TRANSKRIPTOMANALYSE DES AS479::TRPA UND H66 WILDTYPSTAMMES . 86 4.1.5. 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