Holdings: Identifikation und molekulare Charakterisierung hoch-immunogener mykobakterieller T-Zell-Antigene

Identifikation und molekulare Charakterisierung hoch-immunogener mykobakterieller T-Zell-Antigene:

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Bibliographic Details
Main Author:	Woelke, Sören (Author)
Format:	Thesis Book
Language:	German
Published:	Gießen VVB Laufersweiler Verlag 2020
Edition:	1. Auflage
Series:	Edition scientifique
Subjects:	T lymphocytes cell mediated immunity tuberculosis zoonoses molecular genetics techniques antigen testing lymphocyte antigens Doktorarbeit Wissenschaft Uni Hochschulschrift
Online Access:	Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis
Physical Description:	IV, 218 Seiten Diagramme 21 cm, 294 g
ISBN:	9783835968950 3835968955

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_version_	1804184012602736640
adam_text	INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG UND ZIELSTELLUNG DER DISSERTATION ...................................................................... 7 2 LITERATURUEBERSICHT ................................................................................................................ 8 2.1 TUBERKULOSE IN VERGANGENHEIT UND GEGENWART ............................................................ 8 2.2 AETIOLOGIE DER TUBERKULOSE ............................................................................................ 10 2.3 GRUPPE DER NICHT-TUBERKULOESEN MYKOBAKTERIEN ........................................................... 11 2.4 MYCOBACTERIUM FUBERCU/OS/S-KOMPLEX-MYKOBAKTERIEN ............................................... 13 2.5 TUBERKULOSE ALS ZOONOSE ............................................................................................. 15 2.6 IMMUNANTWORT DES WIRTES AUF DIE TUBERKULOSE .......................................................... 16 2.6.1 ANGEBORENE IMMUNANTWORT ................................................................................ 16 2.6.2 ADAPTIVE IMMUNANTWORT AUF MYKOBAKTERIEN ....................................................... 21 2.7 GRANULOMATOESE ENTZUENDUNG DURCH MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS .............................. 24 2.8 AUFBAU DER MYKOBAKTERIELLEN ZELLWAND ....................................................................... 27 2.8.1 IMMUNMODULATION DURCH MYKOBAKTERIELLE LIPID-ANTIGENE ................................. 29 2.8.2 AUSGEWAEHLTE MYKOBAKTERIELLE LIPOPEPTIDE UND DEREN IMMUNMODULIERENDE EIGENSCHAFTEN ..................................................................................................... 32 3 MATERIAL UND METHODEN ...................................................................................................... 36 3.1 BAKTERIOLOGISCHE ARBEITEN ....................................................... 36 3.1.1 VERWENDETE BAKTERIENSTAEMME ........................................................................... 36 3.1.2 KULTIVIERUNG DER GENUTZTEN BAKTERIENSTAEMME .................................................... 36 3.1.3 BESTIMMUNG DER KOLONIE-BILDENDEN-EINHEITEN (KBE) ....................................... 37 3.2 MEDIEN UND PUFFER ........................................................................................................ 38 3.3 ANTIGENE ....................................................................................................................... 38 3.3.1 LOESUNG DER CME UND CHROMATOGRAPHIE-PROBEN IN VERSCHIEDENEN MEDIEN .... 41 3.3.2 VAKUUM-EVAPORATION MYKOBAKTERIELLER PRAEPARATE ............................................ 41 3.3.3 HERSTELLUNG MYKOBAKTERIELLER LYSATE .................................................................. 41 3.4 EXPERIMENTE MIT MENSCHLICHEN ZELLEN ........................................................................ 43 3.4.1 VERWENDETE ZELLLINIEN ......................................................................................... 43 3.4.2 HUMANE BLUTSPENDER ......................................................................................... 43 3.4.3 AUFREINIGUNG VON MONONUKLEAEREN ZELLEN DES PERIPHEREN BLUTES (PBMCS) AUS HUMANEM VOLLBLUT ....................................................................................... 43 3.4.4 GENERIERUNG VON CD1 + -APCS ............................................................................ 44 3.4.5 GENERIERUNG VON T-ZELL-KLONEN MITTELS GRENZVERDUENNUNG ............................... 44 3.4.6 RESTIMULATION VON T-ZELL-KLONEN ........................................................................ 45 3.4.7 TESTUNG DER ANTIGENPRAEPARATE IM B2-STIMULATIONSASSAY .................................. 45 3.4.8 ANALYSE DER ZELLKULTURUEBERSTAENDE MITTELS IFN-Y-ELISA ..................................... 45 3.4.9 HERSTELLUNG DER GETESTETEN ANTIGENANSAETZE ....................................................... 46 3.4.10 INHIBITIONS-EXPERIMENTE ..................................................................................... 49 3.5 TIERVERSUCHE ................................................................................................................ 51 3.5.1 FUER TIERVERSUCHE VERWENDETE MEERSCHWEINCHEN .............................................. 51 3.5.2 HALTUNG DER MEERSCHWEINCHEN .......................................................................... 51 3.5.3 VAKZINIERUNG DER MEERSCHWEINCHEN .................................................................. 51 3.5.4 NARKOTISIERUNG DER MEERSCHWEINCHEN ............................................... 51 3.5.5 GEWINNUNG VON MEERSCHWEINCHEN-VOLLBLUT ....................................................... 52 3.5.6 ISOLATION VON MEERSCHWEINCHEN-PBMCS ........................................................... 52 3.5.7 EUTHANASIE DER MEERSCHWEINCHEN ..................................................................... 52 3.6 FLUESSIGCHROMATOGRAPHISCHE AUFREINIGUNG ................................................................... 53 3.6.1 NORMAL-PHASE-CHROMATOGRAPHIE ....................................................................... 53 3.6.2 UMKEHRPHASE-CHROMATOGRAPHIE ........................................................................ 54 3.7 ZYTOLOGISCHE ARBEITEN UND SERUMAUFARBEITUNG ........................................................... 55 3.7.1 KRYOKONSERVIERUNG VON ZELLEN ........................................................................... 55 3.7.2 AUFTAUEN VON ZELLEN ............................................................................................ 55 3.7.3 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL .................................................................................... 55 3.7.4 CFSE-FAERBUNG VON ZELLEN .................................................................................. 55 3.7.5 FACS-FAERBUNG VON ZELLEN .................................................................................. 56 3.7.6 EX-VIVO-CFSE-PROLIFERATIONSASSAY ..................................................................... 56 3.7.7 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE MESSUNG VON ZELLEN .................................................. 57 3.7.8 AUSWERTUNG VON GEMESSENEN FACS-DATEN ...................................................... 57 3.7.9 GAMMA-BESTRAHLUNG VON PBMCS ...................................................................... 57 3.7.10 GEWINNUNG VON AUTOLOGEM MEERSCHWEINCHEN-SERUM ...................................... 57 3.8 SEQUENZIERUNG DES B2-RESTRIKTIONSELEMENTES ........................................................... 58 3.8.1 RNS-ISOLATION AUS ANTIGENPRAESENTIERENDEN ZELLEN ............................................ 58 3.8.2 REVERSE-TRANSKRIPTION VON RNS-PROBEN IN KOMPLEMENTAERE DNS .................... 58 3.8.3 AMPLIFIZIERUNG DER DNS-PROBEN ......................................................................... 59 3.8.4 AUFREINIGUNG VON DNS-PROBEN MITTELS AGAROSE-GELELEKTROPHORESE ................. 61 3.8.5 EXTRAKTION VON DNS-PROBEN AUS AGAROSE-GELEN ............................................... 61 3.8.6 NEXT-GENERATION -SEQUENZIERUNG DER CDNS-PROBEN ...................................... 61 3.8.7 LIGATION VON DNS-AMPLIFIKATEN IN DEN PGEM-T EASY-PLASMIDVEKTOR ............... 62 3.8.8 TRANSFORMATION DES PLASMIDVEKTORS IN KOMPETENTE E. CO//-BAKTERIENZELLEN .... 63 3.8.9 SANGER-SEQUENZIERUNG DER AUFGEARBEITETEN UND TRANSFORMIERTEN PLASMIDE ....64 3.9 AUFARBEITUNG DER PROBEN FUER DIE FLUESSIGSAEULEN-IONEN-MOBILITAETS-MASSENSPEKTROMETRIE MIT ELEKTROSPRAY-IONISATION (LC-IMS E -MS) ........................................................................ 65 3.9.1 TRYPTISCHER VERDAU DER PROBEN .......................................................................... 65 3.9.2 LC-IMS E -MS-MESSUNG ........................................................................................ 65 3.9.3 AUSWERTUNG DER ERHOBENEN LC-IMS E -MS-DATEN ............................................... 67 3.10 IN-SILICO-ANALYSE VON NUKLEOTIDSEQUENZEN UND DETEKTIERTEN PROTEINEN ..................... 68 3.11 STATISTISCHE ANALYSE ..................................................................................................... 69 4 ERGEBNISSE ......................................................................................................................... 70 4.1 EX-VIVO-NACHWEIS VON MTK-REAKTIVEN T-ZELLEN IN HUMANEN BLUTSPENDERN .............. 70 4.1.1 FACS-DATEN VON NICHT-REAKTIVEN SPENDERN ..................................................... 71 4.1.2 FACS-DATEN DES TUBERKULIN-REAKTIVEN SPENDERS 3 ........................................... 72 4.2 ETABLIERUNG VON HUMANEN T-ZELL-KLONEN MIT REAKTIVITAET FUER MTK-ANTIGENPRAEPARATE ......................................................................... 73 4.3 UNIFORMITAET DES B2-T-ZELL-KLONS .................................................................................. 76 4.4 ABHAENGIGKEIT DER IFN-Y-SEZEMIERUNG VOM B2-KLON UND DEM RESTRINGIERENDEN ELEMENT ..................................................................................... 78 4.5 ABHAENGIGKEIT DER REAKTIVITAET DES B2-T-ZELL-KLONS VON MHC-RESTRIKTIONSELEMENTEN ........................................................................................ 80 II 4.5.1 IDENTIFIZIERUNG DES MHC-RESTRIKTIONSELEMENT-TYPS MIT MONOKLONALEN ANTIKOERPERN .......................................................................................................... 80 4.5.2 IDENTIFIZIERUNG DES MHC-RESTRIKTIONSELEMENTES MITTELS NEXT-GENERATION - SEQUENZIERUNG DER ANTIGENPRAESENTIERENDEN ZELLEN ........................................... 82 4.5.3 SANGERSEQUENZIERUNG DES RESTRIKTIONSELEMENTES ........................................... 87 4.6 CHARAKTERISIERUNG DES VOM T-ZELL-KLON B2 ERKANNTEN ANTIGENS (B2-ANTIGEN) ......... 90 4.6.1 VORKOMMEN DES ANTIGENS INNERHALB DER GATTUNG MYCOBACTERIUM ................... 90 4.6.2 VERDAU UND VERSEIFUNG DES TOTAL-LIPID-EXTRAKTS ............................................... 94 4.6.3 VETERINAERMEDIZINISCH-GENUTZTE TUBERKULINE ....................................................... 95 4.6.4 METABOLISCHE INAKTIVIERUNG VON MYKOBAKTERIEN ................................................. 96 4.7 SEDIMENTATIONSEIGENSCHAFTEN DES B2-ANTIGENS ......................................................... 98 4.8 UNTERSUCHUNGEN ZUR AUFNAHME UND PROZESSIERUNG DES B2-ANTIGENS DURCH APCS ........................................................................................... 100 4.9 FLUESSIGCHROMATOGRAPHISCHE AUFREINIGUNG DES B2-ANTIGENS ..................................... 102 4.9.1 ANTIGENFRAKTIONIERUNG VON CME MITTELS STUFENGRADIENTEN .............................. 102 4.9.2 DREI- UND ZWEISTUFIGE FLUESSIGCHROMATOGRAPHIE IM SAEULENFORMAT ................... 104 4.10 EX-VIVO-TESTUNG VON CHROMATOGRAPHIE-FRAKTIONEN ................................................. 112 4.11 REAKTION DES B2-T-ZELL-KLONS AUF KULTURUEBERSTAENDE EINES BCG-WILDTYPS UND EINER ALNT-BCG-MUTANTE ............................................................ 115 4.12 MASSENSPEKTROMETRISCHE UNTERSUCHUNG DES B2-ANTIGENS ....................................... 118 4.12.1 TRYPSIN-VERDAU DER REAKTIVEN PROBEN ZUR VERBESSERUNG DER MASSENSPEKTROMETRISCHEN ANALYSE ................................................................. 118 4.12.2 ANALYSE DER RP-HPLC-FRAKTIONEN MITTELS LC-IMS E -MS .................................. 121 4.12.3 IN-SILICO-ANALYSE AUSGEWAEHLTER B2-ANTIGEN-KANDIDATEN ................................. 128 5 DISKUSSION ........................................................................................................................ 137 5.1 DIE GENERIERUNG ANTIGENSPEZIFISCHER T-ZELL-KLONE ................................................... 137 5.2 DER B2-T-ZELL-KLON ..................................................................................................... 138 5.3 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISTIKA DES B2-T-ZELL-ANTIGENS ............................................. 139 5.4 DIE MHC-PRAESENTATION DES T-ZELL-ANTIGENS .............................................................. 140 5.5 BILDUNG DES B2-T-ZELL-ANTIGENS DURCH DIE MYKOBAKTERIEN ........................................ 142 5.6 DIE CHROMATOGRAPHISCHE AUFREINIGUNG DES B2-ANTIGENS .......................................... 145 5.7 DER VERGLEICH VON BCG-WILDTYP UND ALNT-BCG-MUTANTE .............................. 146 5.8 DIE EX-VIVO-RELEVANZ DES B2-ANTIGENS .................................................................... 148 5.9 MASSENSPEKTROMETRISCHE IDENTIFIZIERUNG DES B2-T-ZELL-ANTIGENS ............................ 149 5.10 IN-SILICO-UNTERSUCHUNGEN AN AUSGEWAEHLTEN B2-ANTIGEN-KANDIDATEN ...................... 150 6 ZUSAMMENFASSUNG .......................................................................................................... 154 7 SUMMARY .......................................................................................................................... 156 8 LITERATURVERZEICHNIS .......................................................................................................... 159 9 ANHANG ............................................................................................................................. 188 9.1 NUKLEOTIDSEQUENZEN DER MITTELS NEXT-GENERATION -SEQUENZIERUNG BESTIMMTEN CONTIGS ................................................................................................ 188 9.2 MITTELS LC-IMS E -MASSENSPEKTROMETRIE ERMITTELTE PROTEINE ..................................... 192 9.3 MEDIEN, PUFFER, CHEMIKALIEN, LABORGERAET UND ANDERE MATERIALIEN .......................... 197 10 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS .................................................................................................. 206 III 11 ABBILDUNGSLISTE .................................................................................................................210 12 TABELLENLISTE ..................................................................................................................... 213 13 DANKSAGUNG .....................................................................................................................215 14 ERKLAERUNG .......................................................................................................................... 218 IV
adam_txt	INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG UND ZIELSTELLUNG DER DISSERTATION . 7 2 LITERATURUEBERSICHT . 8 2.1 TUBERKULOSE IN VERGANGENHEIT UND GEGENWART . 8 2.2 AETIOLOGIE DER TUBERKULOSE . 10 2.3 GRUPPE DER NICHT-TUBERKULOESEN MYKOBAKTERIEN . 11 2.4 MYCOBACTERIUM FUBERCU/OS/S-KOMPLEX-MYKOBAKTERIEN . 13 2.5 TUBERKULOSE ALS ZOONOSE . 15 2.6 IMMUNANTWORT DES WIRTES AUF DIE TUBERKULOSE . 16 2.6.1 ANGEBORENE IMMUNANTWORT . 16 2.6.2 ADAPTIVE IMMUNANTWORT AUF MYKOBAKTERIEN . 21 2.7 GRANULOMATOESE ENTZUENDUNG DURCH MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS . 24 2.8 AUFBAU DER MYKOBAKTERIELLEN ZELLWAND . 27 2.8.1 IMMUNMODULATION DURCH MYKOBAKTERIELLE LIPID-ANTIGENE . 29 2.8.2 AUSGEWAEHLTE MYKOBAKTERIELLE LIPOPEPTIDE UND DEREN IMMUNMODULIERENDE EIGENSCHAFTEN . 32 3 MATERIAL UND METHODEN . 36 3.1 BAKTERIOLOGISCHE ARBEITEN . 36 3.1.1 VERWENDETE BAKTERIENSTAEMME . 36 3.1.2 KULTIVIERUNG DER GENUTZTEN BAKTERIENSTAEMME . 36 3.1.3 BESTIMMUNG DER KOLONIE-BILDENDEN-EINHEITEN (KBE) . 37 3.2 MEDIEN UND PUFFER . 38 3.3 ANTIGENE . 38 3.3.1 LOESUNG DER CME UND CHROMATOGRAPHIE-PROBEN IN VERSCHIEDENEN MEDIEN . 41 3.3.2 VAKUUM-EVAPORATION MYKOBAKTERIELLER PRAEPARATE . 41 3.3.3 HERSTELLUNG MYKOBAKTERIELLER LYSATE . 41 3.4 EXPERIMENTE MIT MENSCHLICHEN ZELLEN . 43 3.4.1 VERWENDETE ZELLLINIEN . 43 3.4.2 HUMANE BLUTSPENDER . 43 3.4.3 AUFREINIGUNG VON MONONUKLEAEREN ZELLEN DES PERIPHEREN BLUTES (PBMCS) AUS HUMANEM VOLLBLUT . 43 3.4.4 GENERIERUNG VON CD1 + -APCS . 44 3.4.5 GENERIERUNG VON T-ZELL-KLONEN MITTELS GRENZVERDUENNUNG . 44 3.4.6 RESTIMULATION VON T-ZELL-KLONEN . 45 3.4.7 TESTUNG DER ANTIGENPRAEPARATE IM B2-STIMULATIONSASSAY . 45 3.4.8 ANALYSE DER ZELLKULTURUEBERSTAENDE MITTELS IFN-Y-ELISA . 45 3.4.9 HERSTELLUNG DER GETESTETEN ANTIGENANSAETZE . 46 3.4.10 INHIBITIONS-EXPERIMENTE . 49 3.5 TIERVERSUCHE . 51 3.5.1 FUER TIERVERSUCHE VERWENDETE MEERSCHWEINCHEN . 51 3.5.2 HALTUNG DER MEERSCHWEINCHEN . 51 3.5.3 VAKZINIERUNG DER MEERSCHWEINCHEN . 51 3.5.4 NARKOTISIERUNG DER MEERSCHWEINCHEN . 51 3.5.5 GEWINNUNG VON MEERSCHWEINCHEN-VOLLBLUT . 52 3.5.6 ISOLATION VON MEERSCHWEINCHEN-PBMCS . 52 3.5.7 EUTHANASIE DER MEERSCHWEINCHEN . 52 3.6 FLUESSIGCHROMATOGRAPHISCHE AUFREINIGUNG . 53 3.6.1 NORMAL-PHASE-CHROMATOGRAPHIE . 53 3.6.2 UMKEHRPHASE-CHROMATOGRAPHIE . 54 3.7 ZYTOLOGISCHE ARBEITEN UND SERUMAUFARBEITUNG . 55 3.7.1 KRYOKONSERVIERUNG VON ZELLEN . 55 3.7.2 AUFTAUEN VON ZELLEN . 55 3.7.3 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL . 55 3.7.4 CFSE-FAERBUNG VON ZELLEN . 55 3.7.5 FACS-FAERBUNG VON ZELLEN . 56 3.7.6 EX-VIVO-CFSE-PROLIFERATIONSASSAY . 56 3.7.7 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE MESSUNG VON ZELLEN . 57 3.7.8 AUSWERTUNG VON GEMESSENEN FACS-DATEN . 57 3.7.9 GAMMA-BESTRAHLUNG VON PBMCS . 57 3.7.10 GEWINNUNG VON AUTOLOGEM MEERSCHWEINCHEN-SERUM . 57 3.8 SEQUENZIERUNG DES B2-RESTRIKTIONSELEMENTES . 58 3.8.1 RNS-ISOLATION AUS ANTIGENPRAESENTIERENDEN ZELLEN . 58 3.8.2 REVERSE-TRANSKRIPTION VON RNS-PROBEN IN KOMPLEMENTAERE DNS . 58 3.8.3 AMPLIFIZIERUNG DER DNS-PROBEN . 59 3.8.4 AUFREINIGUNG VON DNS-PROBEN MITTELS AGAROSE-GELELEKTROPHORESE . 61 3.8.5 EXTRAKTION VON DNS-PROBEN AUS AGAROSE-GELEN . 61 3.8.6 NEXT-GENERATION -SEQUENZIERUNG DER CDNS-PROBEN . 61 3.8.7 LIGATION VON DNS-AMPLIFIKATEN IN DEN PGEM-T EASY-PLASMIDVEKTOR . 62 3.8.8 TRANSFORMATION DES PLASMIDVEKTORS IN KOMPETENTE E. CO//-BAKTERIENZELLEN . 63 3.8.9 SANGER-SEQUENZIERUNG DER AUFGEARBEITETEN UND TRANSFORMIERTEN PLASMIDE .64 3.9 AUFARBEITUNG DER PROBEN FUER DIE FLUESSIGSAEULEN-IONEN-MOBILITAETS-MASSENSPEKTROMETRIE MIT ELEKTROSPRAY-IONISATION (LC-IMS E -MS) . 65 3.9.1 TRYPTISCHER VERDAU DER PROBEN . 65 3.9.2 LC-IMS E -MS-MESSUNG . 65 3.9.3 AUSWERTUNG DER ERHOBENEN LC-IMS E -MS-DATEN . 67 3.10 IN-SILICO-ANALYSE VON NUKLEOTIDSEQUENZEN UND DETEKTIERTEN PROTEINEN . 68 3.11 STATISTISCHE ANALYSE . 69 4 ERGEBNISSE . 70 4.1 EX-VIVO-NACHWEIS VON MTK-REAKTIVEN T-ZELLEN IN HUMANEN BLUTSPENDERN . 70 4.1.1 FACS-DATEN VON NICHT-REAKTIVEN SPENDERN . 71 4.1.2 FACS-DATEN DES TUBERKULIN-REAKTIVEN SPENDERS 3 . 72 4.2 ETABLIERUNG VON HUMANEN T-ZELL-KLONEN MIT REAKTIVITAET FUER MTK-ANTIGENPRAEPARATE . 73 4.3 UNIFORMITAET DES B2-T-ZELL-KLONS . 76 4.4 ABHAENGIGKEIT DER IFN-Y-SEZEMIERUNG VOM B2-KLON UND DEM RESTRINGIERENDEN ELEMENT . 78 4.5 ABHAENGIGKEIT DER REAKTIVITAET DES B2-T-ZELL-KLONS VON MHC-RESTRIKTIONSELEMENTEN . 80 II 4.5.1 IDENTIFIZIERUNG DES MHC-RESTRIKTIONSELEMENT-TYPS MIT MONOKLONALEN ANTIKOERPERN . 80 4.5.2 IDENTIFIZIERUNG DES MHC-RESTRIKTIONSELEMENTES MITTELS NEXT-GENERATION - SEQUENZIERUNG DER ANTIGENPRAESENTIERENDEN ZELLEN . 82 4.5.3 SANGERSEQUENZIERUNG DES RESTRIKTIONSELEMENTES . 87 4.6 CHARAKTERISIERUNG DES VOM T-ZELL-KLON B2 ERKANNTEN ANTIGENS (B2-ANTIGEN) . 90 4.6.1 VORKOMMEN DES ANTIGENS INNERHALB DER GATTUNG MYCOBACTERIUM . 90 4.6.2 VERDAU UND VERSEIFUNG DES TOTAL-LIPID-EXTRAKTS . 94 4.6.3 VETERINAERMEDIZINISCH-GENUTZTE TUBERKULINE . 95 4.6.4 METABOLISCHE INAKTIVIERUNG VON MYKOBAKTERIEN . 96 4.7 SEDIMENTATIONSEIGENSCHAFTEN DES B2-ANTIGENS . 98 4.8 UNTERSUCHUNGEN ZUR AUFNAHME UND PROZESSIERUNG DES B2-ANTIGENS DURCH APCS . 100 4.9 FLUESSIGCHROMATOGRAPHISCHE AUFREINIGUNG DES B2-ANTIGENS . 102 4.9.1 ANTIGENFRAKTIONIERUNG VON CME MITTELS STUFENGRADIENTEN . 102 4.9.2 DREI- UND ZWEISTUFIGE FLUESSIGCHROMATOGRAPHIE IM SAEULENFORMAT . 104 4.10 EX-VIVO-TESTUNG VON CHROMATOGRAPHIE-FRAKTIONEN . 112 4.11 REAKTION DES B2-T-ZELL-KLONS AUF KULTURUEBERSTAENDE EINES BCG-WILDTYPS UND EINER ALNT-BCG-MUTANTE . 115 4.12 MASSENSPEKTROMETRISCHE UNTERSUCHUNG DES B2-ANTIGENS . 118 4.12.1 TRYPSIN-VERDAU DER REAKTIVEN PROBEN ZUR VERBESSERUNG DER MASSENSPEKTROMETRISCHEN ANALYSE . 118 4.12.2 ANALYSE DER RP-HPLC-FRAKTIONEN MITTELS LC-IMS E -MS . 121 4.12.3 IN-SILICO-ANALYSE AUSGEWAEHLTER B2-ANTIGEN-KANDIDATEN . 128 5 DISKUSSION . 137 5.1 DIE GENERIERUNG ANTIGENSPEZIFISCHER T-ZELL-KLONE . 137 5.2 DER B2-T-ZELL-KLON . 138 5.3 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISTIKA DES B2-T-ZELL-ANTIGENS . 139 5.4 DIE MHC-PRAESENTATION DES T-ZELL-ANTIGENS . 140 5.5 BILDUNG DES B2-T-ZELL-ANTIGENS DURCH DIE MYKOBAKTERIEN . 142 5.6 DIE CHROMATOGRAPHISCHE AUFREINIGUNG DES B2-ANTIGENS . 145 5.7 DER VERGLEICH VON BCG-WILDTYP UND ALNT-BCG-MUTANTE . 146 5.8 DIE EX-VIVO-RELEVANZ DES B2-ANTIGENS . 148 5.9 MASSENSPEKTROMETRISCHE IDENTIFIZIERUNG DES B2-T-ZELL-ANTIGENS . 149 5.10 IN-SILICO-UNTERSUCHUNGEN AN AUSGEWAEHLTEN B2-ANTIGEN-KANDIDATEN . 150 6 ZUSAMMENFASSUNG . 154 7 SUMMARY . 156 8 LITERATURVERZEICHNIS . 159 9 ANHANG . 188 9.1 NUKLEOTIDSEQUENZEN DER MITTELS NEXT-GENERATION -SEQUENZIERUNG BESTIMMTEN CONTIGS . 188 9.2 MITTELS LC-IMS E -MASSENSPEKTROMETRIE ERMITTELTE PROTEINE . 192 9.3 MEDIEN, PUFFER, CHEMIKALIEN, LABORGERAET UND ANDERE MATERIALIEN . 197 10 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS . 206 III 11 ABBILDUNGSLISTE .210 12 TABELLENLISTE . 213 13 DANKSAGUNG .215 14 ERKLAERUNG . 218 IV
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