DNA-Schäden in murinen Podozyten: Aktivierung der mTOR-Signalkaskade
Saved in:
| Main Author: | |
|---|---|
| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
| Published: |
Köln
[2020]
|
| Subjects: | |
| Online Access: | Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis |
| Physical Description: | 127 Blätter Illustrationen, Diagramme 21 cm |
Staff View
MARC
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
................................................................................................
9
1
EINLEITUNG
.....................................................................................................................
12
1.1
D
IE
R
ELEVANZ
CHRONISCHER
N
IERENERKRANKUNGEN
IN
EINER
ALTERNDEN
G
ESELLSCHAFT
.................................................................................................
12
1.2
D
IE
N
IERE
UND
DIE
CHRONISCHE
N
IERENINSUFFIZIENZ
......................................
15
1.3
P
ODOZYTEN
UND
N
IERENERKRANKUNGEN
.........................................................
19
1.4
E
RCC
1
-
DEFIZIENTE
M
AEUSE
ALS
M
ODELL
FUER
VORZEITIGE
A
LTERUNG
..............
24
1.5
ERCC1
-
B
EDEUTUNG
UND
KLINISCHE
B
ILDER
.................................................
24
1.6
D
ER
PODOZYTENSPEZIFISCHE
K
NOCKOUT
VON
E
RCC
1
......................................
29
1.7
D
IE
M
TOR-S
IGNALKASKADE
.............................................................................
34
1.8
Z
IELSETZUNG
DER
A
RBEIT
.................................................................................
37
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.........................................................................................
38
2.1
M
ETHODEN
(K
LONIERUNG
)
...............................................................................
38
2.1.1
ANNEALING
SHRNA
.........................................................................................
38
2.1.2
PHOSPHORYLIERUNG
SHRNA
............................................................................
38
2.1.3
RESTRIKTIONSVERDAU
.......................................................................................
39
2.1.4
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
........................................................................
39
2.1.5
LIGATION
........................................................................................................
40
2.1.6
TRANSFORMATION,
VERMEHRUNG
UND
AUFBEREITUNG
VON
PLASMIDEN
...............
40
2.1.7
SEQUENZIERUNG
.............................................................................................
41
2.1.8
POLYMERASEKETTENREAKTION
..........................................................................
42
2.1.9
GATEWAY-KLONIERUNG
-
KLONIERUNG
IN
PSICHECK-VEKTOR
(LR-REAKTION)
........
43
2.1.10
GATEWAY-KLONIERUNG
-
KLONIERUNG
IN
LENTIVIRALEN
VEKTOR
(BP-
UND
LR-
REAKTION)
......................................................................................................
43
2.2
M
ETHODEN
(Z
ELLKULTUR
)
................................................................................45
2.2.1
ZELLKULTURARBEIT
-
STERILES
ARBEITEN
..............................................................
45
2.2.2
ZELLKULTURARBEIT
-
AUFTAUEN
..........................................................................
45
2.2.3
ZELLKULTURARBEIT
-
EINFRIEREN
.........................................................................
45
2.2.4
ZELLKULTURARBEIT
-
KULTIVIERUNG
......................................................................
46
2.2.5
TRANSFEKTION
IN
HEK293T-ZELLEN
(CALCIUMPHOSPHATKRISTALLMETHODE)
........
47
2.2.6
ETABLIERUNG
STABILE
ZELLLINIE
.........................................................................
48
2.2.7
TRANSFEKTION
IN
NSC-34-
UND
IN
HEK293T-ZELLEN
(LIPOFEKTION)
UND
LUCIFERASE-ASSAY
.........................................................................................
50
6
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.8
MITOMYCIN
C-BEHANDLUNG
VON
HSMP-ZELLEN
..............................................
52
2.3
M
ETHODEN
(
WEITERFUEHRENDE
E
XPERIMENTE
)
................................................
52
2.3.1
ZELLERNTE
FUER
WESTERN-BLOT
...........................................................................
52
2.3.2
PROTEINGEHALTMESSUNG
DER
LYSATE
..............................................................
52
2.3.3
SDS-PAGE
....................................................................................................
53
2.3.4
WESTERN-BLOT
................................................................................................
53
2.3.5
DETEKTION
VON
PROTEINEN
AUF
PVDF-MEMBRAN
............................................
53
2.3.6
ANFAERBEN
VON
ZELLEN
-
IMMUNFLUORESZENZ-METHODE
..................................
54
2.3.7
ANFAERBEN
VON
GEWEBEN
-
IMMUNHISTOCHEMIE-METHODE
............................
55
2.3.8
PULL-DOWNS
-
RAC1
UND
RHOA
....................................................................
57
2.3.9
MIGRATIONSASSAY
...........................................................................................
58
2.3.10
RESCUE-VERSUCH
-
RAPAMYCIN
...................................................................
58
2.3.11
RESCUE-VERSUCH
-
SERUM
STARVATION
..........................................................
59
2.4
M
ATERIAL
.........................................................................................................
60
2.4.1
LOESUNGEN,
CHEMIKALIEN
UND
REAGENZIEN
..................................................
60
2.4.2
PUFFER
UND
LOESUNGEN
...................................................................................
62
2.4.3
MATERIALIEN
...................................................................................................
65
2.4.4
GERAETE
..........................................................................................................
67
2.4.5
OLIGOSEQUENZEN
DER
SHRNAS
UND
SIRNAS
.................................................
69
2.4.6
PLASMIDE
UND
VEKTOREN
...............................................................................
71
2.4.7
KITS
...............................................................................................................
73
2.4.8
RESTRIKTIONSENZYME
......................................................................................
74
2.4.9
PRIMER
FUER
PCR
UND
SEQUENZIERUNG
...........................................................
74
2.4.10
ZELLLINIEN
.......................................................................................................
75
2.4.11
PRIMAERE
ANTIKOERPER
.......................................................................................
76
2.4.12
SEKUNDAERE
ANTIKOERPER
.................................................................................
77
2.4.13
SOFTWARE
.......................................................................................................
77
3
ERGEBNISSE
...................................................................................................................
79
3.1
E
NDOGENES
DNA-D
AMAGE
-Z
ELLKULTURMODELL
-
S
TABILE
Z
ELLLINIE
........
79
3.1.1
MURINES
ERCCL
IST
TRANSFIZIER-
UND
UEBEREXPRIMIERBAR
IN
HEK293T-ZELLEN
..
79
3.1.2
SHRNAS
REGULIEREN
UEBEREXPRIMIERTES
MURINES
ERCD
IN
HEK293T-ZELLEN
IN
VITRO
..............................................................................................................
80
3.1.3
ENDOGENES
MURINES
ERCCL
BEFINDET
SICH
IN
NSC-34-ZELLEN
.......................
82
3.1.4
SHRNAS
REGULIEREN
ENDOGENES
MURINES
ERCD
IN
NSC-34-ZELLEN
IN
VITRO.
83
3.1.5
DIE
ETABLIERUNG
EINER
STABILEN
ZELLLINIE
MIT
ERCD-KNOCK-DOWN
DURCH
SHRNA
WAR
NICHT
ERFOLGREICH
.......................................................................
84
3.2
E
XOGENES
DNA-D
AMAGE
-Z
ELLKULTURMODELL
-
M
ITOMYCIN
C
84
7
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.1
MITOMYCIN
C
INDUZIERT
IN
VITRO
DNA-SCHAEDEN
IN
PODOZYTEN
.......................
84
3.2.2
DNA-GESCHAEDIGTE
PODOZYTEN
AKTIVIEREN
IN
VITRO
DEN
MTOR-SIGNALWEG
...
87
3.2.3
DNA-SCHAEDEN
IN
PODOZYTEN
SORGEN
IN
VITRO
FUER
EINE
AKTIVIERUNG
DES
MTORCI-SIGNALWEGS
.................................................................................
90
3.2.4
DER
MTOR-SIGNALWEG
IST
IN
NEUN
WOCHEN
ALTEN
ERCCL
PK0
-MAEUSEN
SOWIE
IN
96
WOCHEN
ALTEN
WILDTYPMAEUSEN
AKTIVIERT
.................................................
92
3.2.5
DNA-GESCHAEDIGTE
PODOZYTEN
WEISEN
PHAENOTYPISCH
EINE
VERRINGERTE
MIGRATION
IN
VITRO
AUF
....................................................................................
94
3.2.6
IN
VITRO
KOMMT
ES
IN
DNA-GESCHAEDIGTEN
PODOZYTEN
ZU
EINER
AKTIVIERUNG
VON
RAC1
UND
ZU
EINER
LEICHTEN
VERMINDERUNG
DER
RHOA-AKTIVIERUNG
......
95
4
DISKUSSION
....................................................................................................................
99
4.1
R
ATIONALE
,
M
ETHODIK
UND
E
TABLIERUNG
DES
EXOGENEN
DNA-D
AMAGE
-
Z
ELLKULTURMODELLS
......................................................................................
99
4.2
DNA-S
CHAEDEN
,
DIE
M
TOR-S
IGNALKASKADE
UND
CHRONISCHE
N
IERENINSUFFIZIENZ
.......................................................................................
102
4.3
DNA-S
CHAEDEN
IN
MURINEN
P
ODOZYTEN
-
M
ODELL
UND
H
YPOTHESEN
..........
107
5
ZUSAMMENFASSUNG
.................................................................................................
109
6
LITERATURVERZEICHNIS
...........................................................................................
110
7
ANHANG
.........................................................................................................................
124
7.1
A
BBILDUNGSVERZEICHNIS
...............................................................................
124
7.2
T
ABELLENVERZEICHNIS
...................................................................................
125
8
LEBENSLAUF
.................................................................................................................
126
8
|
| adam_txt |
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
9
1
EINLEITUNG
.
12
1.1
D
IE
R
ELEVANZ
CHRONISCHER
N
IERENERKRANKUNGEN
IN
EINER
ALTERNDEN
G
ESELLSCHAFT
.
12
1.2
D
IE
N
IERE
UND
DIE
CHRONISCHE
N
IERENINSUFFIZIENZ
.
15
1.3
P
ODOZYTEN
UND
N
IERENERKRANKUNGEN
.
19
1.4
E
RCC
1
-
DEFIZIENTE
M
AEUSE
ALS
M
ODELL
FUER
VORZEITIGE
A
LTERUNG
.
24
1.5
ERCC1
-
B
EDEUTUNG
UND
KLINISCHE
B
ILDER
.
24
1.6
D
ER
PODOZYTENSPEZIFISCHE
K
NOCKOUT
VON
E
RCC
1
.
29
1.7
D
IE
M
TOR-S
IGNALKASKADE
.
34
1.8
Z
IELSETZUNG
DER
A
RBEIT
.
37
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
38
2.1
M
ETHODEN
(K
LONIERUNG
)
.
38
2.1.1
ANNEALING
SHRNA
.
38
2.1.2
PHOSPHORYLIERUNG
SHRNA
.
38
2.1.3
RESTRIKTIONSVERDAU
.
39
2.1.4
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
39
2.1.5
LIGATION
.
40
2.1.6
TRANSFORMATION,
VERMEHRUNG
UND
AUFBEREITUNG
VON
PLASMIDEN
.
40
2.1.7
SEQUENZIERUNG
.
41
2.1.8
POLYMERASEKETTENREAKTION
.
42
2.1.9
GATEWAY-KLONIERUNG
-
KLONIERUNG
IN
PSICHECK-VEKTOR
(LR-REAKTION)
.
43
2.1.10
GATEWAY-KLONIERUNG
-
KLONIERUNG
IN
LENTIVIRALEN
VEKTOR
(BP-
UND
LR-
REAKTION)
.
43
2.2
M
ETHODEN
(Z
ELLKULTUR
)
.45
2.2.1
ZELLKULTURARBEIT
-
STERILES
ARBEITEN
.
45
2.2.2
ZELLKULTURARBEIT
-
AUFTAUEN
.
45
2.2.3
ZELLKULTURARBEIT
-
EINFRIEREN
.
45
2.2.4
ZELLKULTURARBEIT
-
KULTIVIERUNG
.
46
2.2.5
TRANSFEKTION
IN
HEK293T-ZELLEN
(CALCIUMPHOSPHATKRISTALLMETHODE)
.
47
2.2.6
ETABLIERUNG
STABILE
ZELLLINIE
.
48
2.2.7
TRANSFEKTION
IN
NSC-34-
UND
IN
HEK293T-ZELLEN
(LIPOFEKTION)
UND
LUCIFERASE-ASSAY
.
50
6
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.8
MITOMYCIN
C-BEHANDLUNG
VON
HSMP-ZELLEN
.
52
2.3
M
ETHODEN
(
WEITERFUEHRENDE
E
XPERIMENTE
)
.
52
2.3.1
ZELLERNTE
FUER
WESTERN-BLOT
.
52
2.3.2
PROTEINGEHALTMESSUNG
DER
LYSATE
.
52
2.3.3
SDS-PAGE
.
53
2.3.4
WESTERN-BLOT
.
53
2.3.5
DETEKTION
VON
PROTEINEN
AUF
PVDF-MEMBRAN
.
53
2.3.6
ANFAERBEN
VON
ZELLEN
-
IMMUNFLUORESZENZ-METHODE
.
54
2.3.7
ANFAERBEN
VON
GEWEBEN
-
IMMUNHISTOCHEMIE-METHODE
.
55
2.3.8
PULL-DOWNS
-
RAC1
UND
RHOA
.
57
2.3.9
MIGRATIONSASSAY
.
58
2.3.10
RESCUE-VERSUCH
-
RAPAMYCIN
.
58
2.3.11
RESCUE-VERSUCH
-
SERUM
STARVATION
.
59
2.4
M
ATERIAL
.
60
2.4.1
LOESUNGEN,
CHEMIKALIEN
UND
REAGENZIEN
.
60
2.4.2
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
62
2.4.3
MATERIALIEN
.
65
2.4.4
GERAETE
.
67
2.4.5
OLIGOSEQUENZEN
DER
SHRNAS
UND
SIRNAS
.
69
2.4.6
PLASMIDE
UND
VEKTOREN
.
71
2.4.7
KITS
.
73
2.4.8
RESTRIKTIONSENZYME
.
74
2.4.9
PRIMER
FUER
PCR
UND
SEQUENZIERUNG
.
74
2.4.10
ZELLLINIEN
.
75
2.4.11
PRIMAERE
ANTIKOERPER
.
76
2.4.12
SEKUNDAERE
ANTIKOERPER
.
77
2.4.13
SOFTWARE
.
77
3
ERGEBNISSE
.
79
3.1
E
NDOGENES
DNA-D
AMAGE
-Z
ELLKULTURMODELL
-
S
TABILE
Z
ELLLINIE
.
79
3.1.1
MURINES
ERCCL
IST
TRANSFIZIER-
UND
UEBEREXPRIMIERBAR
IN
HEK293T-ZELLEN
.
79
3.1.2
SHRNAS
REGULIEREN
UEBEREXPRIMIERTES
MURINES
ERCD
IN
HEK293T-ZELLEN
IN
VITRO
.
80
3.1.3
ENDOGENES
MURINES
ERCCL
BEFINDET
SICH
IN
NSC-34-ZELLEN
.
82
3.1.4
SHRNAS
REGULIEREN
ENDOGENES
MURINES
ERCD
IN
NSC-34-ZELLEN
IN
VITRO.
83
3.1.5
DIE
ETABLIERUNG
EINER
STABILEN
ZELLLINIE
MIT
ERCD-KNOCK-DOWN
DURCH
SHRNA
WAR
NICHT
ERFOLGREICH
.
84
3.2
E
XOGENES
DNA-D
AMAGE
-Z
ELLKULTURMODELL
-
M
ITOMYCIN
C
84
7
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.1
MITOMYCIN
C
INDUZIERT
IN
VITRO
DNA-SCHAEDEN
IN
PODOZYTEN
.
84
3.2.2
DNA-GESCHAEDIGTE
PODOZYTEN
AKTIVIEREN
IN
VITRO
DEN
MTOR-SIGNALWEG
.
87
3.2.3
DNA-SCHAEDEN
IN
PODOZYTEN
SORGEN
IN
VITRO
FUER
EINE
AKTIVIERUNG
DES
MTORCI-SIGNALWEGS
.
90
3.2.4
DER
MTOR-SIGNALWEG
IST
IN
NEUN
WOCHEN
ALTEN
ERCCL
PK0
-MAEUSEN
SOWIE
IN
96
WOCHEN
ALTEN
WILDTYPMAEUSEN
AKTIVIERT
.
92
3.2.5
DNA-GESCHAEDIGTE
PODOZYTEN
WEISEN
PHAENOTYPISCH
EINE
VERRINGERTE
MIGRATION
IN
VITRO
AUF
.
94
3.2.6
IN
VITRO
KOMMT
ES
IN
DNA-GESCHAEDIGTEN
PODOZYTEN
ZU
EINER
AKTIVIERUNG
VON
RAC1
UND
ZU
EINER
LEICHTEN
VERMINDERUNG
DER
RHOA-AKTIVIERUNG
.
95
4
DISKUSSION
.
99
4.1
R
ATIONALE
,
M
ETHODIK
UND
E
TABLIERUNG
DES
EXOGENEN
DNA-D
AMAGE
-
Z
ELLKULTURMODELLS
.
99
4.2
DNA-S
CHAEDEN
,
DIE
M
TOR-S
IGNALKASKADE
UND
CHRONISCHE
N
IERENINSUFFIZIENZ
.
102
4.3
DNA-S
CHAEDEN
IN
MURINEN
P
ODOZYTEN
-
M
ODELL
UND
H
YPOTHESEN
.
107
5
ZUSAMMENFASSUNG
.
109
6
LITERATURVERZEICHNIS
.
110
7
ANHANG
.
124
7.1
A
BBILDUNGSVERZEICHNIS
.
124
7.2
T
ABELLENVERZEICHNIS
.
125
8
LEBENSLAUF
.
126
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