Entwicklung eines monoklonalen Sandwich-ELISA zur direkten Detektion von Blauzungenvirus in infizierten Tieren:
Saved in:
| Main Author: | |
|---|---|
| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
| Published: |
Gießen
VVB Laufersweiler Verlag
2021
|
| Edition: | 1. Auflage |
| Series: | Edition Scientifique
|
| Subjects: | |
| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Physical Description: | 156 Seiten 21 cm x 14.8 cm, 200 g |
| ISBN: | 9783835969315 3835969315 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1
INHALTSVERZEICHNIS
1
2
ABKUERZUNGEN
7
3
VEROEFFENTLICHTER
ARTIKEL
12
4
EINLEITUNG
13
5
ZIELSETZUNG
15
6
LITERATURUEBERSICHT
16
6.1
GENOM
DES
BT
VIRUS
16
6.2
UEBERTRAGUNGSWEGE
DES
BT
VIRUS
18
6.3
PATHOGENESE
UND
KLINISCHES
BILD
DER
BTV
ERKRANKUNG
19
6.4
BTV
EPIDEMISCH
21
6.5
BTV
SITUATION
EUROPA
21
6.5.1
BTV-8
21
6.5.2
BTV-4
22
6.5.3
BTV-3/1/16
22
6.5.4
BTV-8
EPIDEMIE
DEUTSCHLAND
2006-2010
22
6.5.5
RISIKOBEWERTUNG
EINSCHLEPPUNG
DER
BT
8
UND
DER
BT
4
VIREN
IN
DEUTSCHLAND
29
6.6
ZELLBIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGSMETHODEN
IN
DER
BTV
DIAGNOSTIK
29
6.6.1
VERMEHRUNG
DER
BT
VIREN
FUER
DEN
DIAGNOSTISCHEN
EINSATZ
29
6.6.2
VIRUSISOLIERUNG
IN
HUEHNEREMBRYONEN
29
6.6.3
VIRUSISOLIERUNG
IN
ZELLKULTUREN
30
6.6.4
VIRUSISOLIERUNG
IN
SCHAFEN
(VERSUCHSTIER)
30
6.7
METHODE
ZUM
DIREKTEN
NACHWEIS
VON
BT
VIREN
IN
DER
BTV
DIAGNOSTIK
30
6.7.1
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
30
1
6.8
AMTLICHE
NACHWEISVERFAHREN
BTV
31
6.8.1
AMTLICHE
METHODENSAMMLUNG
BLAUZUNGENKRANKHEIT
DES
FLI
31
6.8.2
METHODENSAMMLUNG
OIE
31
6.9
NUKLEINSAEURENACHWEIS
BTV
31
6.9.1
PCR-TECHNOLOGIE
31
6.9.2
HYBRIDISIERUNG
32
6.10
IMMUNOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGSMETHODEN
32
6.10.1
VIRUSNEUTRALISATIONSTEST/PLAQUENEUTRALISATIONSTEST
32
6.10.2
IMMUNFLUORESZENZ-VERFAHREN
32
6.10.3
HAEMAGGLUTINATIONSTEST/HAEMAGGLUTANATIONSHEMMTEST
33
6.10.4
AGARGELIMMUNDIFFUSIONSTEST
(AGID)
33
6.10.5
KOMPLEMENTBINDUNGSREAKTION
(KBR)
33
6.10.6
ELISA
(ENZYME
LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY)
33
6.10.7
KOMPETITIVER
ELISA
(BLOCKING-ELISA)
34
6.10.8
POLYKLONALER
SANDWICH-ELISA
35
6.10.9
MONOKLONALER
BTV-8
SANDWICH-ELISA
36
7
MATERIAL
UND
METHODEN
38
7.1
BTV
ANTIGEN
HERSTELLUNG
UND
AUFBEREITUNG
38
7.1.1
BTV
ANTIGEN
HERSTELLUNG
38
7.1.2
AUSFAELLUNG
DER
VIRUSPROTEINE
MIT
AMMONIUMSULFAT
38
7.1.3
ULTRAZENTRIFUGATION
(PEI)
38
7.1.4
PRAEZIPITATION
39
7.1.5
RESOLUBILISIERUNG
39
7.1.6
ULTRAZENTRIFUGATION
39
7.2
ANTIKOERPERFORMATE
39
7.3
VERWENDETE
EXPRESSIONSVEKTOREN
43
2
7.3.1
AUFBAU
DER
VEKTOREN
43
7.4
PRIMER
46
7.5
MUTAGENESE
PRIMER
47
7.6
ZELLLINIEN,
BAKTERIEN
UND
ZELLKULTUREN
49
7.7
ZELLKULTUREN
50
7.8
KULTIVIERUNG
DER
ZELLEN
50
7.9
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
50
7.9.1
POLYMERASE-KETTENREAKTION
50
7.9.2
DURCHFUEHRUNG
DER
PCR
51
7.9.3
AGAROSE-GELELKTROPHORESE
52
7.9.4
BESTIMMUNG
DES
NUKLEINSAEUREGEHALTS
UND
DER
REINHEIT
52
7.9.5
SEQUENZIERUNG
53
7.9.6
PLASMIDPRAEPARATION
53
7.9.7
RESTRIKTIONSVERDAU
UND
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
54
7.9.8
HITZESCHOCKTRANSFORMATION
VON
E.
COLI
55
7.9.9
ORTSGERICHTETE
MUTAGENESE
57
7.10
PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN
58
7.10.1
PROKARYOTISCHE
ANTIKOERPEREXPRESSION
58
7.10.2
AUFREINIGUNG
DER
ANTIKOERPERFRAGMENTE
MITTELS
IMMOBILISIERTEM
METALLCHELAT
59
7.10.3
HERSTELLUNG
DER
SCFV-FC-FUSIONSPROTEINE
61
7.10.4
TRANSFEKTION
SCFV-FUSIONSPROTEIN
KODIERENDER
PLASMIDE
IN
HEK
293T
ZELLEN
62
7.10.5
ELISA-BASIERENDE
BINDUNGSANALYSEN
DER
SCFV-FC-FUIONS
PROTEINE
62
7.10.6
HERSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
FABFRAGMENTEN
63
7.11
PHAGE-DISPLAY
64
3
65
7.11.1
TOMLINSON-BIBLIOTHEKEN
I
UND
J
7.11.2
AUFBAU
DER
PHAGEN
65
7.11.3
HELFERPHAGE
66
7.11.4
HYPERPHAGE
67
7.11.5
PRODUKTION
DER
SCFV-PRAESENTIERENDEN
PHAGEN
67
7.11.6
PANNING/SELEKTION
69
7.12
POLYKLONALER
ELISA
72
7.13
MONOKLONALER
ELISA
72
7.14
AUFBAU
DES
BTV
SANDWICH-ELISAS
73
7.15
VALIDIERUNG
DER
BTV
SANDWICH-ELISA
S
74
7.16
UNTERSUCHUNG
DER
SEROGRUPPEN
BTV-1/
BTV-4,
BTV-8
UND
BTV-1
6
IM
BTV-8
ELISA
AUF
BINDUNGSAFFINITAET
74
7.17
DATENANALYSE
75
8
ERGEBNISSE
76
8.1
BT
8
VIRUSPARTIKEL-AUFREINIGUNG
76
8.2
POLYKLONALE
ANALYSE
DER
SELEKTIONIERTEN
ANTIKOERPERFRAGMENTE
76
8.2.1
GRAPHISCHE
DARSTELLUNG
DER
AFFINITAETS
BZW.
BINDUNGS
ANREICHERUNG
76
8.2.2
BESTIMMUNG
DES
INPUT/OUTPUT
TITERS
78
8.3
MONOKLONALER
PHAGEN-ELISA
80
8.4
SEQUENZIERUNG
DER
KLONE
82
8.5
HERSTELLUNG
DER
SCFV-FUSIONSPROTEINE
84
8.6
EUKARYOTISCHE
HERSTELLUNG
DER
SCFV-FUSIONSPROTEINE
85
8.7
BINDUNGSANALYSE
DER
SCFV-FUSIONSPROTEINE
IM
ELISA
86
8.8
ERMITTLUNG
DER
BTV-8
NACHWEISGRENZE
DER
SCFC-FUSIONSPROTEINE
87
8.9
NACHWEIS
VON
BTV-8
VIRUSPARTIKELN
IM
INFIZIERTEN
SCHAF
89
8.10
PRODUKTION
VON
FABFRAGMENTEN
91
4
8.11
AUFBAU
DER
BTV
SANDWICH-ELISAS
92
8.12
SANDWICH-ELISA-KONTROLLEN
92
8.13
SPEZIFISCHE
DETEKTION
VON
BT
8
VIREN
IM
SCHAFSERUM
MITTELS
SANDWICH-ELISA
95
8.14
NACHWEISGRENZE
DES
SANDWICH-ELISA
97
8.15
UEBERPRUEFUNG
DER
BTV
SEROGRUPPEN
1/4/8
UND
16
IM
ELISA
100
9
DISKUSSION
102
9.1
BTV
ANTIKOERPER
103
9.2
DIREKTER
BTV
NACHWEIS
UEBER
SANDWICH-ELISA
104
9.3
VORTEILE
BEIM
EINSATZ
VON
REKOMBINANTEN
BTV
SANDWICH-ELISAS
105
9.4
BTV
NUKLEINSAEURENACHWEIS
107
9.5
KLASSISCHE
BTV
NACHWEISTECHNIKEN
109
9.6
VALIDIERUNG
DES
BTV
SANDWICH-ELISAS
112
9.7
BTV
EPIDEMIESITUATION
112
9.8
AUSBLICK
117
10
ZUSAMMENFASSUNG
118
11
SUMMARY
119
12
VERZEICHNISSE
120
12.1
LITERATURVERZEICHNIS
120
12.2
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
132
12.3
TABELLENVERZEICHNIS
139
13
ANHANG
141
13.1
PROTOKOLL
BTV
AUFREINIGUNG
141
13.2
VERBRAUCHSMATERIALIEN,
PUFFER,
NAEHRBOEDEN
UND
LOESUNGEN
142
13.3
REAGENZIEN
146
13.3.1
ANTIKOERPER
146
13.3.2
BAKTERIENSTAEMME
146
5
13.4
ENZYME
147
13.5
MEDIEN
148
13.6
MOLEKULARGEWICHTSMARKER
148
13.7
PRIMER
149
13.8
PRIMER
ORTSGERICHTETE
MUTAGENESE
150
13.9
PUFFER
UND
LOESUNGEN
150
13.10
REAKTIONSKITS
152
13.11
ZELLLINIEN
153
13.12
SOFTWARE
154
13.13
GERAETE
154
14
DANKSAGUNG
156
6
|
| adam_txt |
1
INHALTSVERZEICHNIS
1
INHALTSVERZEICHNIS
1
2
ABKUERZUNGEN
7
3
VEROEFFENTLICHTER
ARTIKEL
12
4
EINLEITUNG
13
5
ZIELSETZUNG
15
6
LITERATURUEBERSICHT
16
6.1
GENOM
DES
BT
VIRUS
16
6.2
UEBERTRAGUNGSWEGE
DES
BT
VIRUS
18
6.3
PATHOGENESE
UND
KLINISCHES
BILD
DER
BTV
ERKRANKUNG
19
6.4
BTV
EPIDEMISCH
21
6.5
BTV
SITUATION
EUROPA
21
6.5.1
BTV-8
21
6.5.2
BTV-4
22
6.5.3
BTV-3/1/16
22
6.5.4
BTV-8
EPIDEMIE
DEUTSCHLAND
2006-2010
22
6.5.5
RISIKOBEWERTUNG
EINSCHLEPPUNG
DER
BT
8
UND
DER
BT
4
VIREN
IN
DEUTSCHLAND
29
6.6
ZELLBIOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGSMETHODEN
IN
DER
BTV
DIAGNOSTIK
29
6.6.1
VERMEHRUNG
DER
BT
VIREN
FUER
DEN
DIAGNOSTISCHEN
EINSATZ
29
6.6.2
VIRUSISOLIERUNG
IN
HUEHNEREMBRYONEN
29
6.6.3
VIRUSISOLIERUNG
IN
ZELLKULTUREN
30
6.6.4
VIRUSISOLIERUNG
IN
SCHAFEN
(VERSUCHSTIER)
30
6.7
METHODE
ZUM
DIREKTEN
NACHWEIS
VON
BT
VIREN
IN
DER
BTV
DIAGNOSTIK
30
6.7.1
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
30
1
6.8
AMTLICHE
NACHWEISVERFAHREN
BTV
31
6.8.1
AMTLICHE
METHODENSAMMLUNG
BLAUZUNGENKRANKHEIT
DES
FLI
31
6.8.2
METHODENSAMMLUNG
OIE
31
6.9
NUKLEINSAEURENACHWEIS
BTV
31
6.9.1
PCR-TECHNOLOGIE
31
6.9.2
HYBRIDISIERUNG
32
6.10
IMMUNOLOGISCHE
UNTERSUCHUNGSMETHODEN
32
6.10.1
VIRUSNEUTRALISATIONSTEST/PLAQUENEUTRALISATIONSTEST
32
6.10.2
IMMUNFLUORESZENZ-VERFAHREN
32
6.10.3
HAEMAGGLUTINATIONSTEST/HAEMAGGLUTANATIONSHEMMTEST
33
6.10.4
AGARGELIMMUNDIFFUSIONSTEST
(AGID)
33
6.10.5
KOMPLEMENTBINDUNGSREAKTION
(KBR)
33
6.10.6
ELISA
(ENZYME
LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY)
33
6.10.7
KOMPETITIVER
ELISA
(BLOCKING-ELISA)
34
6.10.8
POLYKLONALER
SANDWICH-ELISA
35
6.10.9
MONOKLONALER
BTV-8
SANDWICH-ELISA
36
7
MATERIAL
UND
METHODEN
38
7.1
BTV
ANTIGEN
HERSTELLUNG
UND
AUFBEREITUNG
38
7.1.1
BTV
ANTIGEN
HERSTELLUNG
38
7.1.2
AUSFAELLUNG
DER
VIRUSPROTEINE
MIT
AMMONIUMSULFAT
38
7.1.3
ULTRAZENTRIFUGATION
(PEI)
38
7.1.4
PRAEZIPITATION
39
7.1.5
RESOLUBILISIERUNG
39
7.1.6
ULTRAZENTRIFUGATION
39
7.2
ANTIKOERPERFORMATE
39
7.3
VERWENDETE
EXPRESSIONSVEKTOREN
43
2
7.3.1
AUFBAU
DER
VEKTOREN
43
7.4
PRIMER
46
7.5
MUTAGENESE
PRIMER
47
7.6
ZELLLINIEN,
BAKTERIEN
UND
ZELLKULTUREN
49
7.7
ZELLKULTUREN
50
7.8
KULTIVIERUNG
DER
ZELLEN
50
7.9
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
50
7.9.1
POLYMERASE-KETTENREAKTION
50
7.9.2
DURCHFUEHRUNG
DER
PCR
51
7.9.3
AGAROSE-GELELKTROPHORESE
52
7.9.4
BESTIMMUNG
DES
NUKLEINSAEUREGEHALTS
UND
DER
REINHEIT
52
7.9.5
SEQUENZIERUNG
53
7.9.6
PLASMIDPRAEPARATION
53
7.9.7
RESTRIKTIONSVERDAU
UND
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
54
7.9.8
HITZESCHOCKTRANSFORMATION
VON
E.
COLI
55
7.9.9
ORTSGERICHTETE
MUTAGENESE
57
7.10
PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN
58
7.10.1
PROKARYOTISCHE
ANTIKOERPEREXPRESSION
58
7.10.2
AUFREINIGUNG
DER
ANTIKOERPERFRAGMENTE
MITTELS
IMMOBILISIERTEM
METALLCHELAT
59
7.10.3
HERSTELLUNG
DER
SCFV-FC-FUSIONSPROTEINE
61
7.10.4
TRANSFEKTION
SCFV-FUSIONSPROTEIN
KODIERENDER
PLASMIDE
IN
HEK
293T
ZELLEN
62
7.10.5
ELISA-BASIERENDE
BINDUNGSANALYSEN
DER
SCFV-FC-FUIONS
PROTEINE
62
7.10.6
HERSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
VON
FABFRAGMENTEN
63
7.11
PHAGE-DISPLAY
64
3
65
7.11.1
TOMLINSON-BIBLIOTHEKEN
I
UND
J
7.11.2
AUFBAU
DER
PHAGEN
65
7.11.3
HELFERPHAGE
66
7.11.4
HYPERPHAGE
67
7.11.5
PRODUKTION
DER
SCFV-PRAESENTIERENDEN
PHAGEN
67
7.11.6
PANNING/SELEKTION
69
7.12
POLYKLONALER
ELISA
72
7.13
MONOKLONALER
ELISA
72
7.14
AUFBAU
DES
BTV
SANDWICH-ELISAS
73
7.15
VALIDIERUNG
DER
BTV
SANDWICH-ELISA
'
S
74
7.16
UNTERSUCHUNG
DER
SEROGRUPPEN
BTV-1/
BTV-4,
BTV-8
UND
BTV-1
6
IM
BTV-8
ELISA
AUF
BINDUNGSAFFINITAET
74
7.17
DATENANALYSE
75
8
ERGEBNISSE
76
8.1
BT
8
VIRUSPARTIKEL-AUFREINIGUNG
76
8.2
POLYKLONALE
ANALYSE
DER
SELEKTIONIERTEN
ANTIKOERPERFRAGMENTE
76
8.2.1
GRAPHISCHE
DARSTELLUNG
DER
AFFINITAETS
BZW.
BINDUNGS
ANREICHERUNG
76
8.2.2
BESTIMMUNG
DES
INPUT/OUTPUT
TITERS
78
8.3
MONOKLONALER
PHAGEN-ELISA
80
8.4
SEQUENZIERUNG
DER
KLONE
82
8.5
HERSTELLUNG
DER
SCFV-FUSIONSPROTEINE
84
8.6
EUKARYOTISCHE
HERSTELLUNG
DER
SCFV-FUSIONSPROTEINE
85
8.7
BINDUNGSANALYSE
DER
SCFV-FUSIONSPROTEINE
IM
ELISA
86
8.8
ERMITTLUNG
DER
BTV-8
NACHWEISGRENZE
DER
SCFC-FUSIONSPROTEINE
87
8.9
NACHWEIS
VON
BTV-8
VIRUSPARTIKELN
IM
INFIZIERTEN
SCHAF
89
8.10
PRODUKTION
VON
FABFRAGMENTEN
91
4
8.11
AUFBAU
DER
BTV
SANDWICH-ELISAS
92
8.12
SANDWICH-ELISA-KONTROLLEN
92
8.13
SPEZIFISCHE
DETEKTION
VON
BT
8
VIREN
IM
SCHAFSERUM
MITTELS
SANDWICH-ELISA
95
8.14
NACHWEISGRENZE
DES
SANDWICH-ELISA
97
8.15
UEBERPRUEFUNG
DER
BTV
SEROGRUPPEN
1/4/8
UND
16
IM
ELISA
100
9
DISKUSSION
102
9.1
BTV
ANTIKOERPER
103
9.2
DIREKTER
BTV
NACHWEIS
UEBER
SANDWICH-ELISA
104
9.3
VORTEILE
BEIM
EINSATZ
VON
REKOMBINANTEN
BTV
SANDWICH-ELISAS
105
9.4
BTV
NUKLEINSAEURENACHWEIS
107
9.5
KLASSISCHE
BTV
NACHWEISTECHNIKEN
109
9.6
VALIDIERUNG
DES
BTV
SANDWICH-ELISAS
112
9.7
BTV
EPIDEMIESITUATION
112
9.8
AUSBLICK
117
10
ZUSAMMENFASSUNG
118
11
SUMMARY
119
12
VERZEICHNISSE
120
12.1
LITERATURVERZEICHNIS
120
12.2
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
132
12.3
TABELLENVERZEICHNIS
139
13
ANHANG
141
13.1
PROTOKOLL
BTV
AUFREINIGUNG
141
13.2
VERBRAUCHSMATERIALIEN,
PUFFER,
NAEHRBOEDEN
UND
LOESUNGEN
142
13.3
REAGENZIEN
146
13.3.1
ANTIKOERPER
146
13.3.2
BAKTERIENSTAEMME
146
5
13.4
ENZYME
147
13.5
MEDIEN
148
13.6
MOLEKULARGEWICHTSMARKER
148
13.7
PRIMER
149
13.8
PRIMER
ORTSGERICHTETE
MUTAGENESE
150
13.9
PUFFER
UND
LOESUNGEN
150
13.10
REAKTIONSKITS
152
13.11
ZELLLINIEN
153
13.12
SOFTWARE
154
13.13
GERAETE
154
14
DANKSAGUNG
156
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