Regulation der metabolischen Kinase Sch9 im Wechselspiel von TORC1 und Snf1 in Saccharomyces cerevisiae:
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| Main Author: | |
|---|---|
| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
| Published: |
Freiburg im Breisgau
August 2020
|
| Subjects: | |
| Online Access: | Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis |
| Physical Description: | 80 Seiten Illustrationen, Diagramme 30 cm |
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| 502 | |b Dissertation |c Albert-Ludwigs-Universität Freiburg |d 2020 | ||
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
1
ZUSAMMENFASSUNG
........................................................................................................................
4
2
EINLEITUNG
......................................................................................................................................
5
2.1
DIE
SCH9-KINASE
..................................................................................................................
5
2.2
PDK
UND
T0RC1
REGULIEREN
DIE
AKTIVITAET
VON
SCH9
......................................................
6
2.3
SCH9
BEEINFLUSST
DIE
LEBENSDAUER
EUKARYOTISCHER
ZELLEN
...............................................
7
2.4
TARGETPROTEINE,
DEREN
AKTIVITAET
VON
SCH9
REGULIERT
WIRD
...............................................
7
2.4.1
SCH9
REGULIERT
DIE
AKTIVITAET
DER
KINASE
RIML
5
.......................................................
7
2.4.2
REGULATION
DER
RIBOSOMALEN
BIOGENESE
.....................................................................
8
2.4.3
SCH9
REGULIERT
DIE
AKTIVITAET
VON
TRANSKRIPTIONSREPRESSOREN,
WELCHE
DIE
RIBOSOMALE
BIOGENESE
BEEINFLUSSEN
...........................................................................................
8
2.5
SNFL
UND
DIE
GLUKOSE-REPRESSION
.....................................................................................
9
2.5.1
REGULATION
DES
SNF-KOMPLEXES
................................................................................
9
2.5.2
DER
SNF-KOMPLEX
....................................................................................................
10
2.5.3
WIRKUNG
DES
SNF1-KOMPLEXES
...............................................................................
11
2.5.4
SNFL
-
UND
DER
TORC
1
-SIGNALWEG
............................................................................
12
2.6
TARGET
OF
RAPAMYCIN
COMPLEX
1
(TORC1)
...................................................................
12
2.6.1
REGULATION
VON
TORC
1
..............................................................................................
13
2.7
INTERAKTIONSMODELL
VON
TORC1,
SNFL
UND
SCH9
.............................................................
15
3
MATERIAL
UND
METHODEN
.............................................................................................................
17
3.1
REAGENZIEN
UND
GERAETE
......................................................................................................
17
3.2
PRIMER,
PLASMIDE
UND
HEFESTAEMME
.................................................................................
20
3.3
LOESUNGEN
UND
PUFFER
.........................................................................................................
22
3.3.1
COOMASSIE
FAERBUNG
UND
SDS-PAGE
......................................................................
22
3.3.2
WESTERN
BLOT
ANALYSE
................................................................................................
23
3.3.3
IN
VITRO
KINASE-ASSAY
................................................................................................
24
3.4
MEDIEN
................................................................................................................................
24
3.5
MOLEKULARBIOLOGISCHE
TECHNIKEN
....................................................................................
25
3.5.1
GENERIERUNG
VON
VEKTOREN
UND
HEFESTAEMMEN
.......................................................
25
3.5.2
WACHSTUM
VON
HEFEKULTUREN
UND
GLUKOSEDEPLETIONSEXPERIMENTE
......................
27
3.5.3
WACHSTUMSANALYSE
IN
FLUESSIGEM
MEDIUM
..............................................................
27
3.5.4
WACHSTUMSANALYSE
AUF
AGARPLATTEN
........................................................................
27
3.6
BIOCHEMISCHE
METHODEN
..................................................................................................28
3.6.1
HERSTELLUNG
VON
TOTAL-ZELLEXTRAKTEN
........................................................................28
3.6.2
TCA
PRAEZIPITATION
VON
PROTEINEXTRAKTEN
................................................................28
1
3.6.3
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMID
GEL
ELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.......................
28
3.6.4
PHOS-TAG*
SDS-PAGE
.............................................................................................
28
3.6.5
COOMASSIE-FAERBUNG
...................................................................................................
29
3.6.6
WESTERN
BLOT
ANALYSE
........................................................................
29
3.6.7
REINIGUNG
VON
SCH9-FLAG
UND
SNF1
(UEBER
FLAG-SNFL)
.........................................
30
3.6.8
RADIOAKTIVER
32
P-KINASE
ASSAY
................................................................................
31
3.6.9
NICHT-RADIOAKTIVER
KINASE
ASSAY
.............................................................................
31
4
ERGEBNISSE
..................................................................................................................................
33
4.1
SNFL
IST
EINE
KINASE
VON
SCH9
.........................................................................................
33
4.1.1
PHOSPHORYLIERUNGSMUSTER
VON
SCH9
AUF
EINEM
PHOS-TAG*
GEL
..........................
33
4.2
SNF1
PHOSPHORYLIERT
SCH9-S288
IN
VITRO
.......................................................................
35
4.2.1
REINIGUNG
VON
SNF
1
UND
SCH9
................................................................................
35
4.2.2
RADIOAKTIVER
KINASE-ASSAY
......................................................................................36
4.2.3
KINASE-ASSAY
MIT
HILFE
VON
PHOS-TAG*
ANALYSE
..................................................37
4.3
DIE
SCH9-MUTANTE
SERIN
S288A
BESITZT
KEINEN
PHAENOTYP
............................................39
4.3.1
SCH9-S288A
VERURSACHT
KEINE
WACHSTUMSDEFEKTE
................................................39
4.4
ZEITLICHER
VERLAUF
DER
PHOSPHORYLIERUNG
UND
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
SCH9
BEIM
AKUTEN
ENTZUG
VON
GLUKOSE
.........................................................................................................
42
4.4.1
SCH9
WIRD
BEIM
GLUKOSEENTZUG
LANGSAMER
DEPHOSPHORYLIERT
ALS
DIE
MUTANTE
SCH9-S288A
..............................................................................................................................
42
4.5
DIE
SNFL-ABHAENGIGE
PHOSPHORYLIERUNG
VON
SCH9
FOLGT
DEM
VERLAUF
DER
TORC1-
ABHAENGIGEN
PHOSPHORYLIERUNG
....................................................................................................
43
4.6
DYNAMIK
DER
TORC
1
-ABHAENGIGEN
PHOSPHORYLIERUNG
BEI
LANGEM
GLUKOSEENTZUG....
45
4.7
RAPAMYCIN
BEEINFLUSST DIE
TORC
1
-ABHAENGIGE
PHOSPHORYLIERUNG
UND
NICHT
DIE
PDK-
ODER
SNFL
-ABHAENGIGE
PHOSPHORYLIERUNG
VON
SCH9
...................................................................48
4.8
DIE
SNFL
-MUTANTE
S4
13
A
HAT
KEINEN
EINFLUSS
AUF
DIE
TORC
1
ODER
SNFL
-ABHAENGIGE
PHOSPHORYLIERUNG
VON
SCH9
.........................................................................................................
49
4.9
DIE
TORC
1
-ABHAENGIGE
PHOSPHORYLIERUNG
HAT
KEINEN
EINFLUSS
AUF
DIE
SNFL
-
ABHAENGIGE
PHOSPHORYLIERUNG
VON
SCH9
.....................................................................................
52
4.10
REGL
UND
GLC7
SIND
UEBERGEORDNETE
REGULATOREN
VON
SNFL
UND
FOLGLICH
VON
SCH9
...
53
4.10.1
REGL
IST
EIN
REGULATOR
DER
SNFL
-AKTIVITAET
UND
FOLGLICH
AUCH
DER
SCH9-AKTIVITAET
53
4.10.2
REGL
BESTIMMT
AUCH
UEBER
DIE
AKTIVITAET
VON
DER
SCH9-MUTANTE
S288A
.............
55
4.10.3
GLC7
IST
EIN
REGULATOR
DER
SNFL
-AKTIVITAET
UND
FOLGLICH
DER
SCH9-AKTIVITAET
......
55
5
DISKUSSION
.................................................................................................................................
59
5.1
SNFL
PHOSPHORYLIERT
SCH9
AN
SERIN
288
..........................................................................59
5.2
DIE
MUTATION
DER
SNFL-ABHAENGIGEN
PHOSPHORYLIERUNG
VON
SCH9
HAT
KEINEN
PHAENOTYP
61
2
5.3
ZEITLICHER
VERLAUF
DER
PHOSPHORYLIERUNG
VON
SCH9
UNTER
DEM
ENTZUG
VON
GLUKOSE
62
5.4
SCH9
WIRD
BEIM
GLUKOSEENTZUG
LANGSAMER
DEPHOSPHORYLIERT
ALS
DIE
MUTANTE
SCH9-
S288A
............................................................................................................................................
63
5.5
DIE
PHOSPHORYLIERUNG
VON
SNFL-T210
UND
SCH9-S288
VERLAEUFT
GEGENLAEUFIG
ZUR
TORC
1
-ABHAENGIGEN
PHOSPHORYLIERUNG
VON
SCH9
....................................................................65
5.6
RAPAMYCIN
BEEINFLUSST
DIE
TORC
1
-ABHAENGIGE
SCH9-PHOSPHORYLIERUNG,
ABER
NICHT
DIE
SNFL-ABHAENGIGE
SCH9-PHOSPHORYLIERUNG
...................................................................................
65
5.7
DIE
SNFL-MUTANTE
S413A
HAT
KEINEN
EINFLUSS
AUF
DIE
TORC1-
UND
SNFL-ABHAENGIGE
PHOSPHORYLIERUNG
VON
SCH9
.........................................................................................................
66
5.8
DIE
SCH9-AKTIVITAET
HAT
KEINEN
EINFLUSS
AUF
DIE
SNF1-AKTIVITAET
................................
67
5.9
REGL
UND
GLC7
SIND
UEBERGEORDNETE
REGULATOREN
VON
SNF1
UND
DAMIT
AUCH
DER
PHOSPHORYLIERUNG
UND AKTIVITAET
VON
SCH9
..................................................................................
67
5.10
DER
ENTZUG
VON
GLUKOSE
ODER
DIE
DELETION
VON
REGL
HABEN
KEINEN EINFLUSS
AUF
DIE
PDK-ABHAENGIGE
PHOSPHORYLIERUNG
VON
SCH9
.............................................................................68
5.11
DAS
HSP70
HOMOLOG
SSB
HAT
EINEN
ENTSCHEIDENDEN
EINFLUSS
AUF
DIE AKTIVIERUNG
DES
GESAMTEN
SNFL-TORC
1
SIGNALWEGES
UND
SCH9
.........................................................................
69
5.12
AUSBLICK
..............................................................................................................................
69
6
LITERATURVERZEICHNIS
..................................................................................................................
72
7
DANKSAGUNG
................................................................................................................................80
3
|
| adam_txt |
INHALTSVERZEICHNIS
1
ZUSAMMENFASSUNG
.
4
2
EINLEITUNG
.
5
2.1
DIE
SCH9-KINASE
.
5
2.2
PDK
UND
T0RC1
REGULIEREN
DIE
AKTIVITAET
VON
SCH9
.
6
2.3
SCH9
BEEINFLUSST
DIE
LEBENSDAUER
EUKARYOTISCHER
ZELLEN
.
7
2.4
TARGETPROTEINE,
DEREN
AKTIVITAET
VON
SCH9
REGULIERT
WIRD
.
7
2.4.1
SCH9
REGULIERT
DIE
AKTIVITAET
DER
KINASE
RIML
5
.
7
2.4.2
REGULATION
DER
RIBOSOMALEN
BIOGENESE
.
8
2.4.3
SCH9
REGULIERT
DIE
AKTIVITAET
VON
TRANSKRIPTIONSREPRESSOREN,
WELCHE
DIE
RIBOSOMALE
BIOGENESE
BEEINFLUSSEN
.
8
2.5
SNFL
UND
DIE
GLUKOSE-REPRESSION
.
9
2.5.1
REGULATION
DES
SNF-KOMPLEXES
.
9
2.5.2
DER
SNF-KOMPLEX
.
10
2.5.3
WIRKUNG
DES
SNF1-KOMPLEXES
.
11
2.5.4
SNFL
-
UND
DER
TORC
1
-SIGNALWEG
.
12
2.6
TARGET
OF
RAPAMYCIN
COMPLEX
1
(TORC1)
.
12
2.6.1
REGULATION
VON
TORC
1
.
13
2.7
INTERAKTIONSMODELL
VON
TORC1,
SNFL
UND
SCH9
.
15
3
MATERIAL
UND
METHODEN
.
17
3.1
REAGENZIEN
UND
GERAETE
.
17
3.2
PRIMER,
PLASMIDE
UND
HEFESTAEMME
.
20
3.3
LOESUNGEN
UND
PUFFER
.
22
3.3.1
COOMASSIE
FAERBUNG
UND
SDS-PAGE
.
22
3.3.2
WESTERN
BLOT
ANALYSE
.
23
3.3.3
IN
VITRO
KINASE-ASSAY
.
24
3.4
MEDIEN
.
24
3.5
MOLEKULARBIOLOGISCHE
TECHNIKEN
.
25
3.5.1
GENERIERUNG
VON
VEKTOREN
UND
HEFESTAEMMEN
.
25
3.5.2
WACHSTUM
VON
HEFEKULTUREN
UND
GLUKOSEDEPLETIONSEXPERIMENTE
.
27
3.5.3
WACHSTUMSANALYSE
IN
FLUESSIGEM
MEDIUM
.
27
3.5.4
WACHSTUMSANALYSE
AUF
AGARPLATTEN
.
27
3.6
BIOCHEMISCHE
METHODEN
.28
3.6.1
HERSTELLUNG
VON
TOTAL-ZELLEXTRAKTEN
.28
3.6.2
TCA
PRAEZIPITATION
VON
PROTEINEXTRAKTEN
.28
1
3.6.3
DENATURIERENDE
POLYACRYLAMID
GEL
ELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
28
3.6.4
PHOS-TAG*
SDS-PAGE
.
28
3.6.5
COOMASSIE-FAERBUNG
.
29
3.6.6
WESTERN
BLOT
ANALYSE
.
29
3.6.7
REINIGUNG
VON
SCH9-FLAG
UND
SNF1
(UEBER
FLAG-SNFL)
.
30
3.6.8
RADIOAKTIVER
32
P-KINASE
ASSAY
.
31
3.6.9
NICHT-RADIOAKTIVER
KINASE
ASSAY
.
31
4
ERGEBNISSE
.
33
4.1
SNFL
IST
EINE
KINASE
VON
SCH9
.
33
4.1.1
PHOSPHORYLIERUNGSMUSTER
VON
SCH9
AUF
EINEM
PHOS-TAG*
GEL
.
33
4.2
SNF1
PHOSPHORYLIERT
SCH9-S288
IN
VITRO
.
35
4.2.1
REINIGUNG
VON
SNF
1
UND
SCH9
.
35
4.2.2
RADIOAKTIVER
KINASE-ASSAY
.36
4.2.3
KINASE-ASSAY
MIT
HILFE
VON
PHOS-TAG*
ANALYSE
.37
4.3
DIE
SCH9-MUTANTE
SERIN
S288A
BESITZT
KEINEN
PHAENOTYP
.39
4.3.1
SCH9-S288A
VERURSACHT
KEINE
WACHSTUMSDEFEKTE
.39
4.4
ZEITLICHER
VERLAUF
DER
PHOSPHORYLIERUNG
UND
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
SCH9
BEIM
AKUTEN
ENTZUG
VON
GLUKOSE
.
42
4.4.1
SCH9
WIRD
BEIM
GLUKOSEENTZUG
LANGSAMER
DEPHOSPHORYLIERT
ALS
DIE
MUTANTE
SCH9-S288A
.
42
4.5
DIE
SNFL-ABHAENGIGE
PHOSPHORYLIERUNG
VON
SCH9
FOLGT
DEM
VERLAUF
DER
TORC1-
ABHAENGIGEN
PHOSPHORYLIERUNG
.
43
4.6
DYNAMIK
DER
TORC
1
-ABHAENGIGEN
PHOSPHORYLIERUNG
BEI
LANGEM
GLUKOSEENTZUG.
45
4.7
RAPAMYCIN
BEEINFLUSST DIE
TORC
1
-ABHAENGIGE
PHOSPHORYLIERUNG
UND
NICHT
DIE
PDK-
ODER
SNFL
-ABHAENGIGE
PHOSPHORYLIERUNG
VON
SCH9
.48
4.8
DIE
SNFL
-MUTANTE
S4
13
A
HAT
KEINEN
EINFLUSS
AUF
DIE
TORC
1
ODER
SNFL
-ABHAENGIGE
PHOSPHORYLIERUNG
VON
SCH9
.
49
4.9
DIE
TORC
1
-ABHAENGIGE
PHOSPHORYLIERUNG
HAT
KEINEN
EINFLUSS
AUF
DIE
SNFL
-
ABHAENGIGE
PHOSPHORYLIERUNG
VON
SCH9
.
52
4.10
REGL
UND
GLC7
SIND
UEBERGEORDNETE
REGULATOREN
VON
SNFL
UND
FOLGLICH
VON
SCH9
.
53
4.10.1
REGL
IST
EIN
REGULATOR
DER
SNFL
-AKTIVITAET
UND
FOLGLICH
AUCH
DER
SCH9-AKTIVITAET
53
4.10.2
REGL
BESTIMMT
AUCH
UEBER
DIE
AKTIVITAET
VON
DER
SCH9-MUTANTE
S288A
.
55
4.10.3
GLC7
IST
EIN
REGULATOR
DER
SNFL
-AKTIVITAET
UND
FOLGLICH
DER
SCH9-AKTIVITAET
.
55
5
DISKUSSION
.
59
5.1
SNFL
PHOSPHORYLIERT
SCH9
AN
SERIN
288
.59
5.2
DIE
MUTATION
DER
SNFL-ABHAENGIGEN
PHOSPHORYLIERUNG
VON
SCH9
HAT
KEINEN
PHAENOTYP
61
2
5.3
ZEITLICHER
VERLAUF
DER
PHOSPHORYLIERUNG
VON
SCH9
UNTER
DEM
ENTZUG
VON
GLUKOSE
62
5.4
SCH9
WIRD
BEIM
GLUKOSEENTZUG
LANGSAMER
DEPHOSPHORYLIERT
ALS
DIE
MUTANTE
SCH9-
S288A
.
63
5.5
DIE
PHOSPHORYLIERUNG
VON
SNFL-T210
UND
SCH9-S288
VERLAEUFT
GEGENLAEUFIG
ZUR
TORC
1
-ABHAENGIGEN
PHOSPHORYLIERUNG
VON
SCH9
.65
5.6
RAPAMYCIN
BEEINFLUSST
DIE
TORC
1
-ABHAENGIGE
SCH9-PHOSPHORYLIERUNG,
ABER
NICHT
DIE
SNFL-ABHAENGIGE
SCH9-PHOSPHORYLIERUNG
.
65
5.7
DIE
SNFL-MUTANTE
S413A
HAT
KEINEN
EINFLUSS
AUF
DIE
TORC1-
UND
SNFL-ABHAENGIGE
PHOSPHORYLIERUNG
VON
SCH9
.
66
5.8
DIE
SCH9-AKTIVITAET
HAT
KEINEN
EINFLUSS
AUF
DIE
SNF1-AKTIVITAET
.
67
5.9
REGL
UND
GLC7
SIND
UEBERGEORDNETE
REGULATOREN
VON
SNF1
UND
DAMIT
AUCH
DER
PHOSPHORYLIERUNG
UND AKTIVITAET
VON
SCH9
.
67
5.10
DER
ENTZUG
VON
GLUKOSE
ODER
DIE
DELETION
VON
REGL
HABEN
KEINEN EINFLUSS
AUF
DIE
PDK-ABHAENGIGE
PHOSPHORYLIERUNG
VON
SCH9
.68
5.11
DAS
HSP70
HOMOLOG
SSB
HAT
EINEN
ENTSCHEIDENDEN
EINFLUSS
AUF
DIE AKTIVIERUNG
DES
GESAMTEN
SNFL-TORC
1
SIGNALWEGES
UND
SCH9
.
69
5.12
AUSBLICK
.
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LITERATURVERZEICHNIS
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DANKSAGUNG
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