Tumorzellabstoßung und durch das Immunsystem verhinderte Rezidive in einem 3P-RNA adjuvantierten Ganzzellvakzinmodell des Ovarialkarzinoms:
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Bonn
2020
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ABKUERZUNGS
VERZEICHNIS
......................................................................................
8
1.
EINLEITUNG
...........................................................................................................
12
1.1.
DAS
IMMUNSYSTEM
..............................................................................................
12
1.2.
MUSTERERKENNUNGSREZEPTOREN
(PRR)
.................................................................
13
1.2.1.
ERKENNUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
............................................................................
14
1.2.2.
ERKENNUNG
ZYTOSOLISCHER
RNA
DURCH
RIG-I-IIKE
REZEPTOREN
..............................
14
1.2.3.
ERKENNUNG
ZYTOSOLISCHER
DNA............................................................................
17
1.3.
DAS
INTERFERON
SYSTEM
........................................................................................
20
1.4.
APOPTOSE
.............................................................................................................
22
1.5.
DIE
CRISPR/CAS9
METHODE
...............................................................................
23
1.6.
T
UMORBIOLOGIE
....................................................................................................
24
1.7.
DAS
OVARIALKARZINOM
..........................................................................................
26
1.8.
VORARBEITEN
..........................................................................................................
28
1.9.
ZIELE
....................................................................................................................
30
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.....................................................................................
31
2.1.
MATERIAL
...............................................................................................................
31
2.1.1.
GERAETE
.................................................................................................................
31
2.1.2.
VERBRAUCHSMATERIALIEN
........................................................................................
33
2.1.3.
CHEMIKALIEN
........................................................................................................
34
2.1.4.
ELISA
..................................................................................................................
37
2.1.5.
TRANSFEKTIONSREAGENZIEN
.....................................................................................
37
2.1.6.
ENZYME
...............................................................................................................
37
2.1.7.
ANTIKOERPER
............................................................................................................
38
2.1.8.
ZYTOKINE
...............................................................................................................
39
2.1.9.
CHEMOKOMPETENTE
BAKTERIEN
.............................................................................
39
6
2.1.10.
VIRUS
.....................................................................................................................
39
2.1.11.
KITS
.......................................................................................................................
40
2.1.12.
OLIGONUKLEOTIDE
...................................................................................................
40
2.1.13.
NUKLEINSAEUREN
.....................................................................................................
41
2.1.14.
PLASMIDE
.............................................................................................................
42
2.1.15.
SEQUENZIERUNG
....................................................................................................
42
2.1.16.
MEDIEN,
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.............................................................................
42
2.1.17.
ZELLLINIEN
..............................................................................................................
47
2.1.18.
MAEUSE
.................................................................................................................
48
2.1.19.
VERSUCHSGENEHMIGUNG
.......................................................................................
48
2.1.20.
SOFTWARE
..............................................................................................................
49
2.2.
METHODEN
............................................................................................................
49
2.2.1.
ZELLKULTUR
..............................................................................................................
49
2.2.2.
ISOLATION
VON
ZELLEN
.............................................................................................
51
2.2.3.
STIMULATION
UND
TRANSFEKTION
VON
ZELLEN
.............................................................
51
2.2.4.
GENERIERUNG
VON
KNOCK
OUT
ZELLLINIEN
MITTELS
DEM
CRIPSR/CAS9
SYSTEM
........
53
2.2.5.
ENZYME
LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
(ELISA)
..................................................
57
2.2.6.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
..........................................................................
58
2.2.7.
FLUORESZENZ-DURCHFLUSSZYTOMETRIE
......................................................................
63
2.2.8.
FLUORESZENZAKTIVIERTER
ZELLSORTIERER
.....................................................................
65
2.2.9.
IN
VIVO
VERSUCHE
..................................................................................................
65
2.2.10.
IN
VITRO
RESTIMULATION
...........................................................................................
68
3.
ERGEBNISSE
.........................................................................................................
69
3.1.
ERFOLGREICHE
GANZZELLVAKZINIERUNG
LAESST
SICH
AUCH
UNABHAENGIG
VOM
TYP
I
INTERFERONSYSTEM
UND
DEM
CGAS/STING
SIGNALWEG
ERREICHEN
...........................
69
3.2.
CD4
+
T-ZELLEN
SIND
ESSENTIELL
FUER
EINE
ERFOLGREICHE
IMMUNISIERUNG
....................
71
7
3.3.
BEI
EINER
IN
VITRO
RESTIMULATION
KOMMT
ES
ZU
EINER
ANTIGENABHAENGIGEN
PROLIFERATION
VON
CD4
+
T-ZELLEN
..........................................................................
77
3.4.
DIE
TUMORZELLEN
EXPRIMIEREN
OBERFLAECHENMARKER
VON
ANTIGENPRAESENTIERENDEN
ZELLEN
..................................................................................................................
80
3.5.
KNOCK
OUT
VON
MMAVS,
MSTING
UND
MIFN-AR
IN
DER
ID8
ZELLLINIE
.................
82
3.6.
KNOCK
OUT
DES
MIFN-Y
REZEPTORS,
VON
MSS2-MIKROGLOBULIN
UND
MCIITA
IN
DER
ID8DTR2ALUC
ZELLLINIE
........................................................................................
88
3.7.
AKTIVIERUNG
DER
APOPTOSE
IN
DER
ID8DTR2ALUC
ZELLLINIE
....................................
92
3.8.
KNOCK
OUT
VON
MCASPASE
8
IN
DER
ID8DTR2ALUC
ZELLLINIE
................................
94
3.9.
TESTUNG
DER
ID8DTR2ALUC
KNOCK
OUT
KLONE
IN
VIVO
..........................................
96
4.
DISKUSSION
.......................................................................................................
102
4.1.
DAS
TYP
I
INTERFERONSYSTEM
UND
DER
CGAS/STING
SIGNALWEG
HABEN
KEINEN
EINFLUSS
AUF
DIE
IMMUNISIERUNG
.........................................................................
102
4.2.
DIE
IMMUNISIERUNG
IST
ABHAENGIG
VON
CD4
+
ZELLEN
............................................
103
4.3.
DIE
TUMORZELLEN
WERDEN
NICHT
UEBER
MHC-I
ODER
MHC-II
ERKANNT
.......................
105
4.4.
DIE
TUMORZELLEN
WERDEN
NICHT
UEBER
DIE
AKTIVIERUNG
VON
TODESREZEPTOREN
ELIMINIERT
...........................................................................................................
107
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.........................................................................................
110
6.
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
...................................................................................
112
7.
TABELLENVERZEICHNIS
........................................................................................
114
8.
LITERATURVERZEICHNIS
........................................................................................
115
9.
DANKSAGUNG
.....................................................................................................
132
|
| adam_txt |
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGS
VERZEICHNIS
.
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1.
EINLEITUNG
.
12
1.1.
DAS
IMMUNSYSTEM
.
12
1.2.
MUSTERERKENNUNGSREZEPTOREN
(PRR)
.
13
1.2.1.
ERKENNUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
.
14
1.2.2.
ERKENNUNG
ZYTOSOLISCHER
RNA
DURCH
RIG-I-IIKE
REZEPTOREN
.
14
1.2.3.
ERKENNUNG
ZYTOSOLISCHER
DNA.
17
1.3.
DAS
INTERFERON
SYSTEM
.
20
1.4.
APOPTOSE
.
22
1.5.
DIE
CRISPR/CAS9
METHODE
.
23
1.6.
T
UMORBIOLOGIE
.
24
1.7.
DAS
OVARIALKARZINOM
.
26
1.8.
VORARBEITEN
.
28
1.9.
ZIELE
.
30
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
31
2.1.
MATERIAL
.
31
2.1.1.
GERAETE
.
31
2.1.2.
VERBRAUCHSMATERIALIEN
.
33
2.1.3.
CHEMIKALIEN
.
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2.1.4.
ELISA
.
37
2.1.5.
TRANSFEKTIONSREAGENZIEN
.
37
2.1.6.
ENZYME
.
37
2.1.7.
ANTIKOERPER
.
38
2.1.8.
ZYTOKINE
.
39
2.1.9.
CHEMOKOMPETENTE
BAKTERIEN
.
39
6
2.1.10.
VIRUS
.
39
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KITS
.
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2.1.12.
OLIGONUKLEOTIDE
.
40
2.1.13.
NUKLEINSAEUREN
.
41
2.1.14.
PLASMIDE
.
42
2.1.15.
SEQUENZIERUNG
.
42
2.1.16.
MEDIEN,
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
42
2.1.17.
ZELLLINIEN
.
47
2.1.18.
MAEUSE
.
48
2.1.19.
VERSUCHSGENEHMIGUNG
.
48
2.1.20.
SOFTWARE
.
49
2.2.
METHODEN
.
49
2.2.1.
ZELLKULTUR
.
49
2.2.2.
ISOLATION
VON
ZELLEN
.
51
2.2.3.
STIMULATION
UND
TRANSFEKTION
VON
ZELLEN
.
51
2.2.4.
GENERIERUNG
VON
KNOCK
OUT
ZELLLINIEN
MITTELS
DEM
CRIPSR/CAS9
SYSTEM
.
53
2.2.5.
ENZYME
LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
(ELISA)
.
57
2.2.6.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
58
2.2.7.
FLUORESZENZ-DURCHFLUSSZYTOMETRIE
.
63
2.2.8.
FLUORESZENZAKTIVIERTER
ZELLSORTIERER
.
65
2.2.9.
IN
VIVO
VERSUCHE
.
65
2.2.10.
IN
VITRO
RESTIMULATION
.
68
3.
ERGEBNISSE
.
69
3.1.
ERFOLGREICHE
GANZZELLVAKZINIERUNG
LAESST
SICH
AUCH
UNABHAENGIG
VOM
TYP
I
INTERFERONSYSTEM
UND
DEM
CGAS/STING
SIGNALWEG
ERREICHEN
.
69
3.2.
CD4
+
T-ZELLEN
SIND
ESSENTIELL
FUER
EINE
ERFOLGREICHE
IMMUNISIERUNG
.
71
7
3.3.
BEI
EINER
IN
VITRO
RESTIMULATION
KOMMT
ES
ZU
EINER
ANTIGENABHAENGIGEN
PROLIFERATION
VON
CD4
+
T-ZELLEN
.
77
3.4.
DIE
TUMORZELLEN
EXPRIMIEREN
OBERFLAECHENMARKER
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ANTIGENPRAESENTIERENDEN
ZELLEN
.
80
3.5.
KNOCK
OUT
VON
MMAVS,
MSTING
UND
MIFN-AR
IN
DER
ID8
ZELLLINIE
.
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ZELLLINIE
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88
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APOPTOSE
IN
DER
ID8DTR2ALUC
ZELLLINIE
.
92
3.8.
KNOCK
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MCASPASE
8
IN
DER
ID8DTR2ALUC
ZELLLINIE
.
94
3.9.
TESTUNG
DER
ID8DTR2ALUC
KNOCK
OUT
KLONE
IN
VIVO
.
96
4.
DISKUSSION
.
102
4.1.
DAS
TYP
I
INTERFERONSYSTEM
UND
DER
CGAS/STING
SIGNALWEG
HABEN
KEINEN
EINFLUSS
AUF
DIE
IMMUNISIERUNG
.
102
4.2.
DIE
IMMUNISIERUNG
IST
ABHAENGIG
VON
CD4
+
ZELLEN
.
103
4.3.
DIE
TUMORZELLEN
WERDEN
NICHT
UEBER
MHC-I
ODER
MHC-II
ERKANNT
.
105
4.4.
DIE
TUMORZELLEN
WERDEN
NICHT
UEBER
DIE
AKTIVIERUNG
VON
TODESREZEPTOREN
ELIMINIERT
.
107
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
110
6.
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
.
112
7.
TABELLENVERZEICHNIS
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