Herstellung von zwei rekombinanten Proteinen für eine Mini-Kollagen-basierte FRET-Sonde zur Messung der MMP14-Aktivität:
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Münster
2019
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|---|---|
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1.
EINLEITUNG
.....................................................................................................................
1
1.1
ROLLE
DER
MATRIXMETALLOPROTEINASE
14
(MMP14)
FUER
INVASIVES
WACHSTUM
UND
METASTASIERUNG
VON
TUMOREN
.............................................................................
1
1.2
MMP14
ALS
THERAPEUTISCHER
ANSATZPUNKT
..........................................................
1
1.3
MESSUNG
DER
AKTIVITAET
UND
INHIBITION
DER
MMP14
IM
KONTEXT
DER
NACHBARSCHAFT
ZU
SS1-LNTEGRIN
AUF
DER
ZELLOBERFLAECHE
.............................................
2
1.4
ZIELE
DIESER
ARBEIT
...................................................................................................
3
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
............................................................................................
4
2.1
MATERIAL
.....................................................................................................................
4
2.1.1
GERAETE
UND
SOFTWARE
.......................................................................................
4
2.1.1.1
HEIZBLOECKE
..................................................................................................
4
2.1.1.2
INKUBATOREN
...............................................................................................
4
2.1.1.3
THERMOCYCLER
............................................................................................
4
2.1.1.4
ZENTRIFUGEN
.................................................................................................
4
2.1.1.5
SOFTWARE
......................................................................................................
5
2.1.1.6
SONSTIGE
......................................................................................................
5
2.1.2
CHEMIKALIEN
UND
ORGANISMEN
......................................................................
6
2.1.2.1
BAKTERIEN
.....................................................................................................
6
2.1.2.2
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
MIT
ERKENNUNGSSEQUENZ
......................
6
2.1.2.3
POLYMERASEN
..............................................................................................
6
2.1.2.4
ANTIKOERPER
...................................................................................................
6
2.1.2.5
KITS
UND
MASTERMIX-LOESUNGEN
...............................................................
7
2.1.2.6
OLIGONUKLEOTIDE
(PRIMER)
.........................................................................
7
2.1.2.7
PLASMIDE
.....................................................................................................
8
2.1.2.8
ERWORBENE
PUFFER
......................................................................................
8
2.1.2.9
FRISCH
ANGESETZTE
PUFFER,
MEDIEN
UND
FAERBEMITTEL
...........................
9
2.1.2.10
WEITERE
VERWENDETE
PRODUKTE
............................................................
11
2.2
METHODEN
................................................................................................................
13
2.2.1
ANSETZEN
VON
FLUESSIGKULTUREN
.....................................................................
13
2.2.2
PLASMIDPRAEPARATION
.......................................................................................
13
2.2.3
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
DURCH
PHOTOMETRIE
....................................
13
2.2.4
RESTRIKTIONSVERDAU
........................................................................................
13
2.2.5
HERSTELLUNG
EINES
AGAROSEGELS
...................................................................
14
2.2.6
DNA-GELELEKTROPHORESE
................................................................................
14
2.2.7
DNA-GELEXTRAKTION
.........................................................................................
14
2.2.8
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
............................................................
15
2.2.9
DPNL-VERDAU
...................................................................................................
17
2.2.10
AUFREINIGUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
...........................................................
17
2.2.11
NEBUILDER
HIFI
DNA
ASSEMBLY
..................................................................
17
2.2.12
TRANSFORMATION
MITTELS
HITZESCHOCKVERFAHREN
.......................................
18
2.2.13
TRANSFORMATION
DURCH
ELEKTROPORATION
...................................................
18
2.2.14
KONSERVIEREN
VON
BAKTERIEN
IN
GLYCEROL-STAMMKULTUREN
...................
19
2.2.15
TWO-STEP-PCR
...............................................................................................
19
2.2.16
TRICHLORESSIGSAEURE-FAELLUNG
(TCA-FAELLUNG)
.............................................
19
2.2.17
SDS-PAGE
.....................................................................................................
20
2.2.18
BICINCHONINSAEURE-TEST
(BCA-TEST)
..........................................................
21
2.2.19
WESTERN
BLOT
.................................................................................................
21
2.2.20
KLONIERUNG
DES
GENS
FUER
DEN
INDIKATORSTRANG
DER TRIPELHELIKALEN
FRET-SONDE
..............................................................................................................22
2.2.20.1
EINBAU
VON
ZEHN
WIEDERHOLUNGEN
DER
SEQUENZ
FUER
DIE
AMINOSAEURESEQUENZ
GLYCIN-PROLIN-PROLIN
IN
DAS
PLASMID
PGQ4
...........
24
2.2.20.2
AUSTAUSCH
VON
MCERULEAN3
GEGEN
DAS
FOLDON
.............................
25
2.2.20.3
ERNEUTER
EINBAU
VON
MCERULEANS
....................................................
28
2.2.21
KLONIERUNG
DES
GENS
FUER
DEN
HILFSSTRANG
DER
TRIPELHELIKALEN
FRET-
SONDE
.........................................................................................................................
31
2.2.22
EXPRESSION
DER
PROTEINE
HILFSSTRANG
UND
INDIKATORSTRANG
................
34
2.2.22.1
TRANSFORMATION
IN
E.
COLI
BL21
(DE3)
............................................... 34
2.2.22.2
INDUKTION
DER
EXPRESSION
DER
PROTEINE
HILFSSTRANG
UND
INDIKATORSTRANG
.....................................................................................................34
2.2.23
AUFREINIGUNG
DER
PROTEINE
HILFSSTRANG
UND
INDIKATORSTRANG
.............. 34
3.
ERGEBNISSE
..............................................................................................................36
3.1
KLONIERUNGSSTRATEGIE
FUER
DEN
INDIKATORSTRANG
SOWIE
FUER
DEN
HILFSSTRANG
36
3.1.1
KLONIERUNGSSTRATEGIE
FUER
DEN
INDIKATORSTRANG
..........................................39
3.1.2
KLONIERUNGSSTRATEGIE
FUER
DEN
HILFSSTRANG
.................................................
43
3.2
KLONIERUNG
DES
PLASMIDS
PTHI
MIT
DEM
GEN
FUER
DEN
INDIKATORSTRANG
.....
44
3.2.1
EINBAU
VON
ZEHN
WIEDERHOLUNGEN
DER
SEQUENZ
FUER
DIE
AMINOSAEURESEQUENZ
GLYCIN-PROLIN-PROLIN
IN
DAS
PLASMID
PGQ4
................
44
3.2.2
AUSTAUSCH
VON
MCERULEAN3
GEGEN
DAS
FOLDON
......................................
47
3.2.3
ERNEUTER
EINBAU
VON
MCERULEANS
..............................................................
49
3.3
KLONIERUNG
DES
PLASMIDS
PTHA
MIT
DEM
GEN
FUER
DEN
HILFSSTRANG
............53
3.4
EXPRESSION
DER
PROTEINE
HILFSSTRANG
UND
INDIKATORSTRANG
........................... 57
4.
DISKUSSION
................................................................................................................
64
4.1
KLONIERUNGSSTRATEGIE
FUER
DEN
INDIKATORSTRANG
SOWIE
FUER
DEN
HILFSSTRANG
64
4.1.1
AUSWAHL
DER
METHODEN
ZUR
ZUSAMMENFUEGUNG
DER
DNA-FRAGMENTE
.
64
4.1.2
KLONIERUNGSSTRATEGIE
FUER
DEN
INDIKATORSTRANG
.........................................
65
4.1.3
KLONIERUNGSSTRATEGIE
FUER
DEN
HILFSSTRANG
.................................................
66
4.2
EXPRESSION
UND
AUFREINIGUNG
DER
REKOMBINANTEN
PROTEINE
HILFSSTRANG
UND
INDIKATORSTRANG
....................................................................................................
67
4.3
ZUSAMMENFASSUNG
UND
AUSBLICK
......................................................................
70
5.
LITERATURVERZEICHNIS
................................................................................................
71
6.
DANKSAGUNGEN
.........................................................................................................
72
7.
LEBENSLAUF
................................................................................................................
73
8.
ANHANG
..........................................................................................................................
I
8.1
SEQUENZEN
.................................................................................................................
I
8.1.1
KODIERENDE
SEQUENZ
DER
GELATINOLYTISCHEN
FRET-SONDE
AUF
DEM
PLASMID
PGQ4
..............................................................................................................
I
8.1.2
KODIERENDE
SEQUENZ
FUER
DAS
KONSTRUKT
FCO
AUF
DEM
PLASMID
PFC0-2LL
8.1.3
KODIERENDE
SEQUENZ
FUER
DIE
UM
(GPP)IO
ERGAENZTE
GELATINOLYTISCHE
FRET-SONDE
AUF
DEM
PLASMID
PGQ4-1.1
.............................................................
II
8.1.4
KODIERENDE
SEQUENZ
FUER
DIE
UM
(GPP)IO
UND
FOLDON
ERGAENZTE
GELATINOLYTISCHE
FRET-SONDE
OHNE
MCERULEANS
AUF
DEM
PLASMID
PGQ4-1
.2
......................................................................................................................................
III
8.1.5
ZIELSEQUENZ
FUER
DEN
INDIKATORSTRANG
...........................................................
IV
8.1.6
ZIELSEQUENZ
FUER
DEN
HILFSSTRANG
...................................................................
V
8.1.7
AMINOSAEURESEQUENZ
DES
INDIKATORSTRANGS
................................................
V
8.1.8
AMINOSAEURESEQUENZ
DES
HILFSSTRANGS
....................................................... VI
8.2
ERGAENZENDE
ABBILDUNGEN
...................................................................................
VII
8.2.1
PLASMIDSCHEMA
VON
PFCO-2
.......................................................................
VII
8.2.2
PLASMIDSCHEMA
VON
PMCERULEAN3
..........................................................
VIII
8.2.3
UEBERSICHTSABBILDUNG
ZUR
KLONIERUNGSSTRATEGIE
.......................................
IX
8.3
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
........................................................................................XI
|
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| spelling | Langhorst, Tobias 1995- Verfasser (DE-588)1193757274 aut Herstellung von zwei rekombinanten Proteinen für eine Mini-Kollagen-basierte FRET-Sonde zur Messung der MMP14-Aktivität vorgelegt von Langhorst, Tobias Münster 2019 73, XII Blatt Illustrationen 30 cm txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Dissertation Westfälische Wilhelms-Universität Münster 2019 Beschränkt für den Austausch 1\p Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (DE-588)4773018-3 gnd 2\p Sonde Medizinisches Gerät (DE-588)7610839-9 gnd 3\p Proteine (DE-588)4076388-2 gnd 4\p Plasmid (DE-588)4046270-5 gnd 5\p Kollagen (DE-588)4164652-6 gnd (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content B:DE-101 application/pdf http://d-nb.info/1193674425/04 Inhaltsverzeichnis DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=031648614&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis 1\p maschinell gebildet 0,21741 20190910 DE-101 2\p maschinell gebildet 0,10996 20190910 DE-101 3\p maschinell gebildet 0,07953 20190910 DE-101 4\p maschinell gebildet 0,04077 20190910 DE-101 5\p maschinell gebildet 0,02402 20190910 DE-101 |
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