Zelluläre Charakterisierung des Renin-Angiotensin Systems sowie des Glutamatsystems im hypothalamischen Subfornikal- und Subseptalorgan:
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| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
| Published: |
Giessen
VVB Laufersweiler Verlag
2019
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| Edition: | 1. Auflage |
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| adam_text | Aus dem Institut für
Veterinär-Physiologie und -Biochemie der Justus-Liebig-Universität Gießen
Betreuer: Prof Dr Rüdiger Gerstberger
Zelluläre Charakterisierung des Renin-Angiotensin
Systems sowie des Glutamatsystems im
hypothalamischen Subfornikal- und Subseptalorgan
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades eines
Dr med vet
beim Fachbereich Veterinärmedizin
der Justus-Liebig-Universität Gießen
Eingereicht von
Niklas Grabbe
Tierarzt aus Rinkerode (Westfalen)
Gießen 2019
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG g
1 1 Das Organum subfomicale g
111 Zirkumventrikuläre Organe ohne endotheliale Blut-Hirn Schranke g
112 Neuroanatomie und -histologie des Subfomikalorgans (Säugetier) und
Subseptalorgans (Vogel): Neurone, Gliazellen und Kapillarisierung 12
113 Afferente und efferente Konnektivitäten des Subfomikalorgans bzw
Subseptalorgans 19
1 2 Physiologische Bedeutung des SFOs / SSOs als Zielstruktur für
zirkulierende Botenstoffe oder Ionen 21
121 Interaktion mit Botenstoffen des Immunsystems 21
122 Interaktion mit Botenstoffen des Energiehaushalts 22
123 Interaktion mit Elektrolyten des systemischen extrazellulären
Flüssigkeitsraumes 22
124 Interaktion mit Hormonen für Kreislauf- und Volumenregulation 25
1 3 Das SFO- / SSO-intrinsische Renin-Angiotensin System 31
131 Gewebsspezifische Renin-Angiotensin Systeme des Säugetiers und
Vogels 31
132 Hinweise auf ein Gehirn-, respektive Hypothalamus-, respektive SFO- /
SSO-intrinsisches Renin-Angiotensin System 32
1 4 Afferente und intrinsische Innervation des SFOs: Wichtige
Transmittersysteme 43
141 Das cholinerge Transmittersystem 43
142 Das noradrenerge Transmitter-System 45
143 Das glutamaterge Transmittersystem: ionotrope und metabotrope
Rezeptorsysteme 46
1 5 Fragestellungen und Ziele der Promotionsarbeit 58
2 MATERIAL UND METHODEN 61
2 1 Allgemeine Materialien 61
2 2 Versuchstiere ®3
Inhaltsverzeichnis
221 Ratten 63
222 Eintagsküken 64
2 3 Etablierung neuro-glialer Primärkulturen des rattenspezifischen SFOs und
des vogelspezifischen SSOs 64
231 Lösungen für die Zellkulturpräparation 66
Neurobasal-A / B27 Medium 66
Gey s Balanced Salt Solution (GBSS) 67
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) 67
Dispase l-HBSS Gebrauchslösung 67
232 Etablierung einer neuro-glialen Primärzellkultur zirkumventrikulärer Organe
67
2321 Neuro-gliale Primärzellkultur des Organum subfomicale (Ratte) 68
2322 Neuro-gliale Primärzellkultur des Hypothalamus sowie des Organum
subseptale des Huhns 68
2323 Vorbereitung der Zellkulturkammern 69
2324 Präparation des Organum subfomicale früh postnataler Ratten 70
2325 Etablierung einer neuro-glialen Primärzellkultur des Hypothalamus früh
postnataler Küken 71
2326 Präparation des Organum subseptale von Eintagsküken 73
2 4 Messung der intrazellulären Calciumkonzentration mittels Fura-2 AM
Ratio-Imaging Technik 74
241 Lösungen für Ratio-Imaging Messungen 76
Calciummesspuffer 76
242 Grundlagen der Calcium-Ratio-Imaging Technik 77
243 Messstand für die Calcium-Imaging Versuche 80
244 Vorbereitung der Versuchsdurchführung 81
245 Versuchsdurchführung 82
246 Messprotokolle für die Calcium-Ratio-Imaging Versuche 83
2461 Datenevaluierung und Statistik 96
2 5 Immunzytochemie / Immunhistochemie 98
251 Lösungen für Immunzytochemie 99
Inkubationspuffer für immunzytochemische Untersuchungen 99
Waschpuffer für immunzytochemische Untersuchungen 99
Phosphatpuffer (PB) 99
Inhaltsverzeichnis
2 5 2
2 5 3
2 5 4
2 5 5
2551
26
261
262
263
264
2641
2642
Paraformaldehydlösung (PFA 4 %)
100
Grundlagen der Methode
Verwendete Antikörper / -seren ^
Immunzytochemische Charakterisierung der SFO- respektive SSO
Primärzellkultur 1Q5
Nachweis SFO- und SSO-intrinsischer Neurone in Gehirnschnitten neo-
nataler Ratten und Eintagsküken 108
Auswertung der immunzyto- und -histochemischen Untersuchungen, sowie
der Kresylviolett- und Klüver-Barrera-Färbungen 112
Quantitative real-time PCR 113
Allgemeine Grundlagen 115
Extraktion der RNA aus kultivierten SFO-Zellen 118
Reverse Transkription 120
Durchführung der quantitativen real-time PCR 121
Ermittlung der optimalen endogenen Kontrolle mit Hilfe des Primer Design
“Reference Gene Kits 122
Auswertung der quantitativen real-time PCR 122
3 ERGEBNISSE 124
3 1 Charakterisierung der neuro-glialen Primärzellkultur des Organum
subfornicale neonataler Ratten 124
311 Immunzytochemische Charakterisierung der neuro-glialen Zelltypen in der
SFO-spezifischen Primärzellkultur I25
312 Immunzytochemischer Nachweis wichtiger Neurotransmittersysteme in der
Primärzellkultur des Organum subfornicale I28
3 2
3 2 1
3211
3212
Funktionelle Charakterisierung eines lokalen Renin-Angiotensin Systems
im Organum subfornicale der Ratte ^34
Einsatz der Fura-2 Ratio-Imaging Technik zur Charakterisierung wichtiger
Komponenten des lokalen RAS im Subfornikalorgan der Ratte 135
Superfusionsstimulation der SFO-spezifischen Primärzellkultur mit
Inhibitoren der verschiedenen RAS Schlüsselenzyme
Superfusionsstimulation der SFO-spezifischen Primärzellkultur mit
Angiotensinogen und dem Renin-spezifischen Inhibitor Aliskiren 137
Inhaltsverzeichnis
3213 Superfusionsstimulation der SFO-spezifischen Primärzellkultur mit
Angiotensinogen und dem Chymasen- und Cathepsin-spezifischen
Inhibitor Chymostatin 139
3214 Superfusionsstimulation der SFO-spezifischen Primärzellkultur mit
Angiotensin I und dem ACE-spezifischen Inhibitor Captopril 142
3215 Superfusionsstimulation der SFO-spezifischen Primärzellkultur mit
Angiotensin (1-12) und dem Chymasen- und Cathepsin-spezifischen
Inhibitor Chymostatin 144
3216 Superfusionsstimulation der SFO-spezifischen Primärzellkultur mit ANG
(1-12) und dem ACE-spezifischen Inhibitor Captopril 146
3217 Neurotransmitter coding Angiotensin II responsiver Neurone in der SFO-
spezifischen Primärzellkultur 149
322 Immunzytochemischer Nachweis verschiedener Komponenten eines SFO-
intrinsischen RAS 150
3221 Immunzytochemischer Nachweis der zellulären Expression von Aogen in
der SFO-spezifischen Primärzellkultur 151
3222 Immunzytochemischer Nachweis von zellulärem ANG II in der SFO-
spezifischen Primärzellkultur 154
3223 Immunzytochemischer Nachweis der zellulären Expression von
angiotensin-converting enzyme in der SFO-spezifischen Primärzellkultur
157
3224 Immunzytochemischer Nachweis von ANG (1-12) in der SFO-spezifischen
Primärzellkultur 160
3225 Immunzytochemischer Nachweis der nukleären Translokation des
Transkriptionsfaktors STAT3 nach ANG II Stimulation 161
323 Quantitative real-time PCR für Komponenten des SFO-intrinsischen RAS
163
3 3 Charakterisierung funktionell exprimierter Glutamatrezeptoren im Organum
subfornicale der Ratte 164
331 Funktionelle Charakterisierung glutamaterger Rezeptoren in der SFO-
spezifischen Primärzellkultur mittels Fura-2 Ratio-Imaging Technik 165
3311 Verschiedene Superfusionsstimulationen der SFO-spezifischen
Primärzellkultur mit Glutamat als Grundlage pharmakologischer
Untersuchungen 165
Inhaltsverzeichnis
3312
3313
3314
3315
332
3321
3322
333
34
341
3411
3412
342
3421
3422
3423
Superfusionsstimulation der SFO-spezifischen Primärzellkultur mit
Glutamat in Anwesenheit spezifischer Antagonisten und Agonisten für die
metabotropen Glutamatrezeptoren 1 und 5
Superfusionsstimulation der SFO-spezifischen Primärzellkultur mit
Glutamat zur Charakterisierung ionotroper Glutamatrezeptoren (NMDA-
AMPA- und Kainatrezeptoren)
Modulation Glutamat induzierter intrazellulärer Calciumsignale durch das
Neuropeptid Phoenixin in der SFO-spezifischen Primärzellkultur 193
Neurotransmitter coding Glutamat responsiver Neurone in der SFO-
spezifischen Primärzellkultur 196
Immunzytochemischer Nachweis verschiedener exzitatorischer
metabotroper Glutamatrezeptoren 197
Immunzytochemischer Nachweis von mGIuRI in Neuronen und Astrozyten
der SFO-spezifischen Primärzellkultur 198
Immunzytochemischer Nachweis von mGluR5 in Neuronen und Astrozyten
der SFO-spezifischen Primärzellkultur 200
Quantitative real-time PCR für mGIuRI und mGluR5 202
Etablierung sowie funktionelle und immunzytochemische
Charakterisierung von Primärzellkulturen des Hypothalamus und Organum
subseptale des Huhnes 203
Immunzytochemische und funktionelle Charakterisierung einer neuro-
glialen Primärzellkultur des Hypothalamus früh postnataler Küken 204
Immunzytochemische Charakterisierung der neuro-glialen Primärzellkultur
des Hypothalamus früh postnataler Hühnerküken 204
Einsatz der Fura-2 Ratio-Imaging Technik zum Vitalitätsnachweis von
Neuronen und Astrozyten in der neuro-glialen Primärzellkultur des
Hypothalamus früh postnataler Hühnerküken 206
Immunzytochemische und funktionelle Charakterisierung einer
Primärzellkultur des Organum subseptale 208
Immunzytochemische Charakterisierung der neuro-glialen Primärzellkultur
des Organum subseptale früh postnataler Hühnerküken 209
Dosis-Wirkungs-Beziehung für ANG II Rezeptoren hinsichtlich
intrazellulärer Calciumsignale 210
Superfusionsstimulation der SSO-spezifischen Primärzellkultur mit
Inhibitoren für ACE und den vogelspezifischen ANG II Rezeptor 212
Inhaltsverzeichnis
3424 Superfusionsstimulation der SSO-spezifischen Primärzellkultur mit
Angiotensin I und dem angiotensin-converting enzyme spezifischen
Inhibitor Captopril 214
3425 Superfusionsstimulation der SSO-spezifischen Primärzellkultur mit
aviärem Angiotensin II und dem spezifischen Angiotensin-Rezeptor
Antagonisten [Sar’,lle8]ANG II 216
4 DISKUSSION 219
4 1 Das intrinsische Renin-Angiotensin System (RAS) im Subfomikal- und
Subseptalorgan des Säugetiers bzw Vogels 219
411 SFO-intrinsische Komponenten des RAS 220
412 Angiotensin (1-12) im Subfornikalorgan des Säugetiers 229
413 Angiotensin II bedingte nukleäre Translokation proinflammatorischer
Transkriptionsfaktoren in Zellen des SFOs 231
414 Die de novo Etablierung vogelspezifischer Primärzellkulturen 233
415 SSO-intrinsische Komponenten des RAS 235
4 2 Glutamatrezeptoren im Subfornikalorgan des Säugetiers 238
421 Das glutamaterge System des Organum subfomicale 238
422 Die Expression metabotroper und ionotroper Glutamatrezeptoren im SFO
der Ratte 242
5 ZUSAMMENFASSUNG 251
6 SUMMARY 255
7 VERZEICHNISSE 258
7 1 Abkürzungsverzeichnis 258
7 2 Literaturverzeichnis 262
8 ANHANG 307
8 1 Publikationen 307
811 Originalarbeiten in Fachzeitschriften 307
812 Wissenschaftliche Konferenz- und Fachbeiträge 307
Inhaltsverzeichnis
8 2 Danksagung
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