Holdings: Bornavirusinfektionen bei Säugetieren und Vögeln: Herstellung monoklonaler Antikörper und Entwicklung neuer Verfahren zum Nachweis antiviraler Antikörper

Bornavirusinfektionen bei Säugetieren und Vögeln: Herstellung monoklonaler Antikörper und Entwicklung neuer Verfahren zum Nachweis antiviraler Antikörper:

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Bibliographic Details
Main Author:	Schmid, Susanne (Author)
Format:	Thesis Book
Language:	German
Published:	Gießen, Lahn VVB Laufersweiler Verlag 2019
Series:	Edition Scientifique
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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS .................................................................................................... I ABKUERZUNGSVERZEICHNIS V ABBILDUNGSVERZEICHNIS VIII TABELLENVERZEICHNIS IX 1. EINLEITUNG 1 2. LITERATURUEBERSICHT 3 2. 1 GESCHICHTE 3 2.1.1 BORNASCHE KRANKHEIT 3 2.1.2 NEUROPATHISCHE DRUESENMAGENERWEITERUNG DER PSITTAZIDEN 3 2.2 TAXONOMIE UND PHYIOGENIE 4 2.3 MORPHOLOGIE, GENOMORGANISATION UND EIGENSCHAFTEN 8 2.3.1 MORPHOLOGIE 8 2.3.2 GENOMORGANISATION UND VIRUSPROTEINE 9 2.3.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE BESONDERHEITEN 11 2. 4 EPIDEMIOLOGIE 11 2.4.1 WIRTE UND GEOGRAPHISCHE VERBREITUNG 11 2.4.2 UEBERTRAGUNG 12 2.4.2.1 BORNA DISEASE VIRUS 12 2.4.2.2 AVIAERE BORNAVIREN 12 2.5 PATHOGENESE UND ERKRANKUNG 13 2.5.1 BORNASCHE KRANKHEIT (BORNA DISEASE, BD) 13 2.5.2 NEUROPATHISCHE DRUESENMAGENDILATATION (PROVENTRICULAR DILATATION DISEASE, PDD) 14 2.6 DIAGNOSTIK VON BORNAVIRUSINFEKTIONEN 15 2.6.1 KLINISCHES BILD 15 2.6.2 DIREKTER ERREGERNACHWEIS 15 2.6.3 INDIREKTER ERREGERNACHWEIS 16 2.7 ZIEL DER ARBEIT 18 3. MATERIAL UND METHODEN 20 3.1 MATERIAL 20 3.1.1 ZELLEN 20 3.1.2 VIREN UND ANTIKOERPER 20 3.1.3 BAKTERIEN 20 3.1.4 ALLGEMEINE PUFFER ............................................................................................ 21 3.1.5 MEDIEN UND PUFFER FUER GEWEBEZELL- UND HYBRIDOMZELLKULTUR .......................... 21 3.1.6 ENZYME UND ENZYMPUFFER ............................................................................... 21 3.1.7 PUFFER FUER REVERSE TRANSKRIPTION UND POLYMERASE-KETTENREAKTION .................. 22 3.1.6 VORGEFERTIGTE SYSTEME ..................................................................................... 22 3.1.9 MATERIALIEN UND LOESUNGEN ZUR DNA-KLONIERUNG ............................................. 22 3.1.10 PUFFER UND MATERIALIEN FUER IIFT UND ELISA ....................................................... 22 3.1.11 LOESUNGEN UND PUFFER FUER SDS-PAGE UND COOMASSIE-FAERBUNG .................... 23 3.1.12 LOESUNGEN UND PUFFER ZUR PROTEINREINIGUNG UND - DIALYSE ............................... 23 3.1.13 LOESUNGEN UND PUFFER ZUR ANTIKOERPERREINIGUNG ................................................. 23 3.1.14 SONSTIGE CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN ........................................................... 23 3.1.15 VERBRAUCHSMATERIALIEN ..................................................................................... 24 3.1.16 GERAETE .............................................................................................................. 24 3.1.17 GENBANK-ZUGANGSNUMMERN ............................................................................ 25 3.1.17.1 BORNA DISEASE VIRUS .................................................................................. 25 3.1.17.2 AVIAERE BORNAVIREN ....................................................................................... 25 3.1.17.3 WEITERE BORNAVIREN .................................................................................... 25 3.2 METHODEN .................................................................................................................. 26 3.2.1 ZELLKULTURTECHNIKEN ................................. , ......................................................... 26 3.2.1.1 GEWEBEKULTURZELLEN ..................................................................................... 26 3.2.1.2 HYBRIDOMZELLEN ............................................................................................ 26 3.2.2 REVERSE TRANSKRIPTION-POLYMERASEKETTENREAKTION (RT-PCR) ........................ 27 3.2.2.1 RNA-PRAEPARATION AUS INFIZIERTEN GEWEBEKULTURZELLEN ................................ 27 3.2.2.2 REVERSE TRANSKRIPTION (RT) ......................................................................... 27 3.2.2.3 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) ................................................................ 27 3.2.2.4 PRIMER .......................................................................................................... 27 3.2.2.5 KONTROLL-DNA GREEN FLUORESCENT PROTEIN .................................................... 28 3.2.2.6 ANALYSE DER PCR-PRODUKTE ......................................................................... 28 3.2.2.7 EXTRAKTION DER DNA-FRAGMENTE AUS AGAROSEGELEN .................................... 29 3.2.3 HERSTELLUNG VON REKOMBINANTEN VIRALEN PROTEINEN MIT HILFE DES PET-26-B UND DES PGEX - 6P1 SYSTEMS ........................................................................ 31 3.2.3.1 VEKTOR PET-26-B/UBIQUITIN .......................................................................... 31 3.2.3.2 VEKTOR PGEX-6P-1/15HIS ........................................................................... 31 3.2.3.3 HERSTELLUNG DER GEWUENSCHTEN PLASMIDE ...................................................... 31 3.2.3.4 PROTEINEXPRESSION MITTELS ROSETTA E. COLI - BAKTERIEN ................................. 34 3.2.4 HERSTELLUNG VON REAGENZIEN FUER DIAGNOSTISCHE TESTS .................................... 34 3.2.4.1 REINIGUNG DER PROTEINE MITTELS AFFINITAETSCHROMATOGRAFIE ............................ 34 3.2.4.2 REINIGUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER ............................................................ 35 3.2.4.3 BIOTINYLIERUNG GEREINIGTER MONOKLONALER ANTIKOERPER .................................... 35 3.2.4.4 NACHWEIS DER EXPRIMIERTEN PROTEINE MITTELS IMMUNOBLOT UND ELISA ........ 36 II 3.2.5 HERSTELLUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER GEGEN DIE VIRALEN NUKLEOPROTEINE ZUM EINSATZ IN DIAGNOSTISCHEN TESTVERFAHREN ......................................................... 38 3.2.5.1 HERSTELLUNG DER IMPFANTIGENE ...................................................... 38 3.2.5.2 IMMUNISIERUNG VON BALB/C MAEUSEN ............................................................. 38 3.2.5.3 BESTIMMUNG DES ANTIKOERPERTITERS GEGEN BODV UND PABV MITTELS INDIREKTEM IMMUNFLUORESZENZTEST ................................................................................. 40 3.2.5.4 PRAEPARATION DER MILZZELLEN UND FUSION ........................................................ 40 3.2.5.5 SELEKTION POSITIVER KLONE ............................................................................. 41 3.2.5.6 HALTEN VON HYBRIDOMEN ............................................................................... 42 4. ERGEBNISSE ...................................................................................................................... 43 4.1 HERSTELLUNG RECOMBINANTER VIRALER PROTEINE ............................................................. 43 4.1.1 DAS NUKLEOPROTEIN P40 ALS KANDIDAT FUER EXPRESSION UND IMMUNISIERUNG ..... 43 4.1.2 PROTEINEXPRESSION ............................................................................................ 49 4.1.2.1 UBIQUITIN-FUSIONSPROTEINE ............................................................................ 49 4.1.2.2 GST-FUSIONSPROTEINE ................................................................................... 50 4.2 MONOKLONALE ANTIKOERPER ZUM NACHWEIS VON BORNAVIREN .......................................... 51 4.2.1 DER MONOKLONALE ANTIKOERPER BOI 8 (ANTI-BODV-1-P40) .................................... 51 4.2.2 HERSTELLUNG NEUER MONOKLONALER ANTIKOERPER GEGEN DIE VIRALEN PROTEINE BODV-1 P40 UND PABV-4 P40 ......................................................................... 54 4.2.2.1 HERSTELLUNG DES ANTIGENS ZUR IMMUNISIERUNG VON MAEUSEN ........................ 54 4.2.2.2 IMMUNISIERUNG ............................................................................................ 54 4.2.3 CHARAKTERISIERUNG DER MONOKLONALEN ANTIKOERPER 2C12, 3B7 UND 5B8 ........... 60 4.2.3.1 IMMUNGLOBULIN-SUBKLASSE ........................................................................... 60 4.2.3.2 INDIREKTER IMMUNFLUORESZENZTEST (UFT) ........................................................ 60 4.2.3.3 ELISA ............................................................................................................ 62 4.2.3.4 IMMUNOBLOT .................................................................................................. 63 4.3 ELISA ZUM NACHWEIS VON ANTIKOERPERN GEGEN BORNAVIREN ....................................... 66 4.3.1 INDIREKTER ELISA MIT NICHT GEREINIGTEN PROTEINEN ............................................. 67 4.3.2 INDIREKTER, BIPHASISCHER ELISA MIT GEREINIGTEN ANTIGENEN ............................. 73 4.3.2.1 VORVERSUCH MIT RATTENSEREN ........................................................................ 74 4.3.2.2 DURCHFUEHRUNG DES ELISAS MIT PFERDESEREN ................................................ 75 4.3.2.3 UNTERSUCHUNG WEITERER PFERDESEREN IM INDIREKTEN ELISA .......................... 77 4.3.2.4 UNTERSUCHUNG VON PSITTAZIDENPROBEN IM INDIREKTEN BODV-ELISA ............ 83 4.3.3 ENTWICKLUNG EINES KORNPETITIONSTESTS UNTER VERWENDUNG VON MAK 3B7 ........ 86 4.3.3.1 VORTEIL EINES KOMPETITIVEN TESTS .................................................................. 86 4.3.3.2 BIOTINYLIERUNG DES MAK UND BESTIMMUNG GEEIGNETER KONZENTRATIONEN VON MAK UND DA ......................................................................................... 86 4.3.3.3 MACHBARKEITSSTUDIE MIT RATTENSEREN ........................................................... 88 4.3.3.4 UNTERSUCHUNG VON PFERDESEREN IM CELISA ................................................. 92 4.3.3.5 PROBEN VON PSITTAZIDEN UND WEITEREN SPEZIES IM CELISA ......................... 97 III 4.3.4 VERGLEICH DER ERGEBNISSE AUS IIFT, INDIREKTEM ELISA UND CELISA .......... 100 5. DISKUSSION ..................................................................................................................... 102 5.1 EXPRESSION DER FUSIONSPROTEINE BODV P40 UBI UND PABV P40 UBI ....................... 103 5.2 HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER GEGEN BORNAVIREN.. 104 5.3 ENTWICKLUNG NEUER TESTVERFAHREN ZUM NACHWEIS VON ANTIKOERPERN GEGEN BORNAVIREN ............................................................................................................... 107 5.4 AUSBLICK ................................................................................................................... 120 6 ZUSAMMENFASSUNG ....................................................................................................... 122 7 SUMMARY ....................................................................................................................... 123 8 LITERATURVERZEICHNIS ..................................................................................................... 124 IV
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