Herstellung und funktionelle Charakterisierung synthetischer Riboswitches:
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Leipzig
2018
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG...................................................................................................................................1
SUMMARY....................................................................................................................................................
6
1
EINLEITUNG..........................................................................................................................................
10
1.1 GENREGULATION DURCH
RIBOSWITCHES........................................................................................10
1.1.1 AUFBAU UND FUNKTIONSMECHANISMEN NATUERLICHER
RIBOSWITCHES..................................11
1.1.2 KLASSIFIZIERUNG NATUERLICHER
RIBOSWITCHES..........................................................................14
1.2 SYNTHETISCHE RIBOSWITCHES ALS ELEMENTE ZUR
GENREGULATION...........................................16
1.2.1 BEDEUTUNG KUENSTLICHER RIBOSWITCHES FUER DIE SYNTHETISCHE BIOLOGIE
............................
16
1.2.2 BEDEUTUNG VON IN V/FRO-SELEKTIERTEN APTAMEREN FUER SYNTHETISCHE
RIBOSWITCHES
....
17
1.2.3 SYNTHETISCHE RIBOSWITCHES ZUR GENREGULATION IN
PROKARYOTEN..................................18
1.3 RATIONALES DESIGN SYNTHETISCHER
RIBOSWITCHES..................................................................
20
1.4 ZIELSTELLUNG DIESER A RB
EIT.........................................................................................................22
2 M
ATERIAL..............................................................................................................................................24
2.1
CHEMIKALIEN.................................................................................................................................24
2.2 W
ASSER.........................................................................................................................................
24
2.3 NUKLEOTIDE UND
RADIONUKLEOTIDE............................................................................................
25
2.4
OLIGONUKLEOTIDE...........................................................................................................................25
2.5
PLASMIDE.......................................................................................................................................27
2.6 E NZYM
E........................................................................................................................................28
2.7 PUFFER UND
LOESUNGEN................................................................................................................
28
2.7.1 ALLGEMEINE
PUFFER.................................................................................................................
28
2.7.2
ENZYMREAKTIONSPUFFER.........................................................................................................
29
2.7.3 LOESUNGEN FUER DIE HERSTELLUNG KOMPETENTER E.
COLI-ZEMEN...........................................29
2.7.4 PUFFER FUER
REPORTERGEN-ASSAYS..........................................................................................30
2.7.5 LOESUNGEN FUER STRUCTURE
PROBING........................................................................................30
2.8
ANTIBIOTIKA....................................................................................................................................
30
2.9
NAEHRMEDIEN.................................................................................................................................30
2.10
MIKROORGANISMEN.......................................................................................................................
31
2.11
KITS......................................................................................................................
31
2.12 G E RAE TE
..........................................................................................................................................
31
2.12.1
DOKUMENTATIONSSYSTEME.....................................................................................................31
2.12.2
ELEKTROPHORESESYSTEME.......................................................................................................31
2.12.3 INKUBATOREN, HEIZBLOECKE UND M
IXER..................................................................................32
2.12.4 PHOTOMETER UND
SPEKTROMETER..........................................................................................32
2.12.5
THERMOCYCLER.........................................................................................................................32
2.12.6 ZENTRIFUGEN UND
ROTOREN....................................................................................................
32
2.12.7 SONSTIGE G ERAETE
...............................................
33
2.13 WISSENSCHAFTLICHE
SOFTWARE....................................................................................................33
2.14
SONSTIGES.....................................................................................................................................
33
3 M
ETHODEN..........................................................................................................................................
35
3.1 ALLGEMEINE
NUKLEINSAEURE-METHODEN.....................................................................................35
3.1.1 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON
NUKLEINSAEUREN.............................................................35
3.1.2
PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION...........................................................................................
35
3.1.3 ETHANOL-PRAEZIPITATION VON NUKLEINSAEUREN
........................................................................
35
3.1.4 ELEKTROPHORETISCHE TRENNUNG VON NUKLEINSAEUREN IN AGAROSEGELEN
...........................
36
3.1.5 ELEKTROPHORETISCHE TRENNUNG VON NUKLEINSAEUREN IN
POLYACRYLAMIDGELEN.................36
3.1.6 AUTORADIOGRAPHISCHE DETEKTION VON NUKLEINSAEUREN
.....................................................
36
3.1.7 ISOLIERUNG VON RNA AUS
POLYACRYLAMIDGELEN.................................................................
37
3.2
DNA-METHODEN...........................................................................................................................37
3.2.1 ISOLIERUNG VON PLASM
ID-DNA.............................................................................................
37
3.2.2 ISOLIERUNG VON DNA AUS
AGAROSEGELEN............................................................................37
3.2.3 AMPLIFIKATION VON DNA MITTELS POLYMERASE-KETTENREAKTION
........................................
37
3.2.3.1 DE NOVO-P C R
.................................................................................................................
38
3.2.3.2
ELONGATIONS-PCR...........................................................................................................
39
3.2.3.3 OVERLAP EXTENSION-P C R
................................................................................................39
3.2.3.4
MUTAGENESE-PCR..........................................................................................................
40
3.2.3.5
KOLONIE-PCR...................................................................................................................
40
3.2.4 REINIGUNG VON
PCR-PRODUKTEN........................................................................................
41
3.2.5
RESTRIKTIONSANALYSEN...........................................................................................................
41
3.2.6 KLONIERUNG VON
DNA-FRAGMENTEN....................................................................................41
3.2.6.1
STANDARD-LIGATION..........................................................................................................
41
3 .2 .6 2 BLUNT
END-KLONIERUNG....................................................................................................
41
3.2.7 SEQUENZIERUNG VON DNA NACH DER
KETTENABBRUCH-METHODE.....................................42
3.3
RNA-METHODEN..........................................................................................................................
42
3.3.1 IN
WFRO-TRANSKRIPTION...........................................................................................................
42
3.3.2 5*-ENDMARKIERUNG VON
RNA...............................................................................................
42
3.3.3 STRUKTURANALYSE VON R N A
...................................................................................................43
3.3.3.1 STRUKTURANALYSE VON RNA DURCH IN LINE PROBING
.....................................................
43
3 3.3.2 STRUKTURANALYSE VON RNA DURCH ENZYMATISCHES
PROBING.....................................44
3.3.3.3 HERSTELLEN VON GROESSENSTANDARDS FUER DIE STRUKTURANALYSE VON R N A
..................
44
3.3.4 STRUKTURANALYSE VON RNA MITTELS ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT
ASSAY (E M S A )
.....
45
3.4 ZELL-M
ETHODEN............................................................................................................................45
3.4.1 KULTIVIERUNG VON ESCHERICHIA
COLI......................................................................................
45
3.4.2 LAGERUNG VON
BAKTERIENZELLEN...........................................................................................45
3.4.3 HERSTELLUNG KOMPETENTER Z E LLE N
.......................................................................................
45
3.4.3.1 CHEMISCH KOMPETENTE E.
CO//-ZELLEN.........................................................................
45
3.4.3.2 ELEKTRISCH KOMPETENTE E
CO//-ZELLEN.........................................................................
46
3.4.4 TRANSFORMATION VON ESCHERICHIA
COLI................................................................................
46
3.5 ENZYM -M
ETHODEN......................................................................................................................47
3.5.1 QUANTITATIVE ANALYSE DER SS-GALAKTOSIDASE-AKTIVITAET (O N P G -T
EST)
...........................
47
3.5.2 QUANTITATIVE ANALYSE DER SS-GALAKTOSIDASE-AKTIVITAET MITTELS BLAU-W
EISS-TEST
..........
48
4
ERGEBNISSE.......................................................................................................................................
49
4.1 BIOINFORMATISCHE VORHERSAGE SYNTHETISCHER
RIBOSWITCHES................................................49
4.2 HERSTELLUNG VON
RIBOSWITCH-KONSTRUKTEN.............................................................................54
4.3 KLONIERUNG EINER
TETRACYCLIN-RESISTENZKASSETTE.................................................................
57
4.4 ANALYSE DER REGULATORISCHEN AKTIVITAET VON
TETRACYCLIN-RIBOSWITCHES.............................59
4.5 HERSTELLUNG UND FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG VON HETEROGENEN
TANDEM-
RIBOSWITCHES..............................................................................................................................66
4.6 EINFLUSS WEITERER STRUKTURMERKMALE AUF DIE REGULATORISCHE AKTIVITAET
SYNTHETISCHER
TETRACYCLIN-RIBOSWITCHES.........................................................................................................71
4.7 ANALYSE DER REGULATORISCHEN AKTIVITAET VON STREPTOMYCIN-RIBOSWITCHES
.........................
74
4.6 ANALYSE DER SEKUNDAERSTRUKTUR UND BINDUNGSEIGENSCHAFTEN DES
STREPTOMYCIN-
APTAMERS.....................................................................................................................................
77
5
DISKUSSION.........................................................................................................................................82
5.1 AUSWAHL DER RESISTENZKASSETTE FUER TETRACYCLIN- UND
STREPTOMYCIN-RIBOSWITCHES.....82
5.2 SYNTHETISCHE TETRACYCLIN-RIBOSWITCHES DER IN S/7/CO-VORHERSAGE SIND
FUNKTIONAL
.......
84
5.2.1 BEDEUTUNG DES TERMINATORS FUER DAS REGULATORISCHE POTENZIAL
SYNTHETISCHER
TETRACYCLIN-RIBOSWITCHES...................................................................................................
86
5.2.2 EINFLUSS DER APTAMER-DOMAENE AUF DIE
RIBOSWITCH-FUNKTION......................................68
5.3 WEITERENTWICKLUNG SYNTHETISCHER TETRACYCLIN-RIBOSWITCHES ZU TANDEM-
RIBOSWITCHES..............................................................................................................................
89
5.3.1 VERKNUEPFUNG VON RIBOSWITCH-MODULEN ALS METHODE ZUR ERHOEHUNG IHRES
REGULATORISCHEN
POTENZIALS...................................................................................................89
5.3.2 VERWENDUNG SYNTHETISCHER TETRACYCLIN-RIBOSWITCHES ALS HETEROGENE
TANDEM-
RIBOSWITCHES..........................................................................................................................91
5.4 HERAUSFORDERUNGEN BEI DER HERSTELLUNG SYNTHETISCHER
STREPTOMYCIN-RIBOSWITCHES...94
5.5 ANALYSEMETHODEN ZUR UNTERSUCHUNG DER RIBOSWITCH-FUNKTIONALITAET
.............................
96
5.6 AUSBLICK: RATIONALES DESIGN ALS METHODE ZUR HERSTELLUNG
SYNTHETISCHER
RIBOSWITCHES..............................................................................................................................
96
6
LITERATURVERZEICHNIS.......................................................................................................................101
7
ANHANG.............................................................................................................................................
109
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