Das Virus der porzinen epidemischen Diarrhö: Charakterisierung mittels reverser Genetik
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| Main Author: | |
|---|---|
| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
| Published: |
Giessen
VVB Laufersweiler Verlag
2018
|
| Edition: | 1. Auflage |
| Series: | Edition scientifique
|
| Subjects: | |
| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Physical Description: | XI, 144 Seiten Illustrationen, Diagramme |
| ISBN: | 9783835967472 |
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INHALTSVERZEICHNIS
..........................................................................
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
..................................................................
TABELLENVERZEICHNIS.......................................................................
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.................................................................
1 EINLEITUNG
.............................................................................
1.1 CORONAVIREN
.........................................................................
1.1.1
TAXONOMIE....................................................................
1.1.2 MORPHOLOGIE
.................................................................
1.1.3
GENOMORGANISATION.....................................................
1.1.4 DER CORONAVIRALE REPLIKATIONSZYKLUS
........................
1.2 DAS VIRUS DER PORZINEN EPIDEMISCHEN DIARRHOE (PEDV)
1.2.1 KLINIK UND PATHOGENESE DER P E D .............................
1.2.2 EPIDEMIOLOGIE DER P E D
..............................................
1.2.2.1 ZEITLICHE UND RAEUMLICHE VERBREITUNG DER PED..
1.2.2.2 GLOBALE EVOLUTION VON PEDV-STAEMMEN
.........
1.2.3 VIRULENZFAKTOREN VON P E D V
.......................................
1.2.3.1 DAS PEDV S-PROTEIN............................................
1.2.3.2 DAS AKZESSORISCHE PROTEIN 3
..............................
1.2.4 ZELLKULTURPROPAGATION VON PEDV
...............................
1.2.5
PEDV-VAKZINEN............................................................
1.2.6 REVERSE GENETIK BEI P E D V
.......................................
1.2.7 ZIELSETZUNG DER VORLIEGENDEN ARBEIT
........................
2 MATERIAL & METHODEN
..........................................................
2.1 MATERIAL
..............................................................................
2.1.1
ZELLEN.............................................................................
2.1.1.1 EUKARYOTISCHE ZELLEN............................................
2.1.1.2 PROKARYOTISCHE ZELLEN
..........................................
2.1.2
VIREN...............................................................................
2.1.3
PLASMIDE.......................................................................
2.1.4 ENZYME
.........................................................................
2.1.5
ANTIKOERPER......................................................................
2.1.5.1 PRIMAERANTIKOERPER
..................................................
2.1.5.2 SEKUNDAERANTIKOERPER..............................................
2.1.6 CHEMIKALIEN
.................................................................
..VI
VIII
..IX
...
1
...
1
...2
...4
...6
...8
..13
..13
..15
..15
..18
..20
..20
..22
..22
..23
..25
..26
..28
..28
..28
..28
..28
..28
..28
..29
..30
..30
..30
..30
2.1.7
KITS........................................................................................................................................
32
2.1.8
NAEHRMEDIEN.........................................................................................................................
33
2.1.8.1
BAKTERIENKULTURMEDIEN...............................................................................................33
2.1.8.2
ZELLKULTURMEDIEN..........................................................................................................
33
2.1.8.3
ZELLKULTURZUSAETZE.........................................................................................................
33
2.1.8.4 ZELLKULTURZUSAETZE FUER DAS REVERS-GENETISCHE
SYSTEM............................................34
2.1.8.5 NAEHRMEDIUMZUSAMMENSETZUNG FUER DIE EINZELNEN ZELLLINIEN
..............................
34
2.1.9 LOESUNGEN UND
PUFFER.........................................................................................................
34
2.1.9.1 ALLGEMEINE LOESUNGEN UND
PUFFER............................................................................
34
2.1.9.2 LOESUNGEN UND PUFFER FUER
AGAROSEGELELEKTROPHORESE..........................................34
2.1.9.3 LOESUNGEN UND PUFFER FUER DNA-ISOLIERUNG UND -AUFREINIGUNG
............................
35
2.1.9.4 LOESUNGEN UND PUFFER FUER INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ..........................................35
2.1.9.5 LOESUNGEN UND PUFFER FUER SDS-PAGE UND WESTERN BLOT
.....................................
35
2.1.9.6 MEDIEN UND PUFFER ZUR HERSTELLUNG KOMPETENTER
BAKTERIEN.................................36
2.1.10
VERBRAUCHSMATERIALIEN....................................................................................................
36
2.1.11
GERAETE................................................................................................................................36
2.1.13 SYNTHETISCHE
DNA-OLIGONUKLEOTIDE...............................................................................38
2.1.13.1 OLIGONUKLEOTIDE FUER DIE ERSTELLUNG VON SELEKTIONSPLASMIDEN
............................
38
2.1.13.2 OLIGONUKLEOTIDE ZUR UEBERPRUEFUNG DER SELEKTIONEN
.............................................
40
2.1.13.3 OLIGONUKLEOTIDE ZUR VOLLSTAENDIGKEITSKONTROLLE UND SEQUENZIERUNG
REKOMBINANTER
VACCINIAVIREN..................................................................................................41
2.1.13.4 OLIGONUKLEOTIDE FUER DIE RT-PCR UND
5*-RACE-PCR..........................................42
2.1.13.5 OLIGONUKLEOTIDE FUER DIE AMPLIFIZIERUNG DER
NMN-SEQUENZ..................................43
2.2
METHODEN.................................................................................................................................43
2.2.1 ARBEITEN MIT EUKARYOTISCHEN
ZELLEN.................................................................................43
2.2.1.1 ALLGEMEINE
ZELLKULTURTECHNIKEN.................................................................................43
2.2.1.2 KRYOKONSERVIERUNG VON
ZELLEN..................................................................................43
2.2.1.3
ZELLZAHLBESTIMMUNG...................................................................................................
44
2.2.1.4 INFEKTION VON
ZELLEN....................................................................................................
44
2.2.1.5 TRANSFEKTION VON EUKARYOTISCHEN ZELLEN MIT NUKLEINSAEUREN
...............................
44
2.2.1.5.1 CHEMISCHE T RANSF
EKTION....................................................................................
44
2.2.1.5.2 PHYSIKALISCHE TRANSFEKTION
(ELEKTROPORATION).................................................45
2.2.1.6 GENERIERUNG EINER ZELLLINIE, DIE DAS N-PROTEIN VON PEDV MN
INDUZIERBAR
EXPRIMIERT...................................................................................................................................
45
2.2.1.6.1 SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) UND WESTERN BLOT
ZUR
ERFOLGSKONTROLLE NACH ERSTELLUNG EINER BHK-PEDVMN-N-ZELLLINIE
................................
46
2.2.1.7 INDIREKTE
IMMUNFLUORESZENZ.....................................................................................
47
2.2.2 ARBEITEN MIT PROKARYOTISCHEN
ZELLEN................................................................................47
2.2.2.1 ANZUCHT VON
BAKTERIEN...............................................................................................47
2.2.2.2. HERSTELLUNG KOMPETENTER E. COLI HB101 K -12
......................................................
48
2.2.2.3 T
RANSFORMATION........................................................................................................
48
2.2.3 ARBEITEN MIT
DNA................................................................................................................48
2.2.3.1
STANDARDMETHODEN....................................................................................................
48
2.2.3.1.1 POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)...................................................................48
2.2.3.1.2 ORTSGERICHTETE MUTAGENESE
..............................................................................
49
2.2.3.1.3 SPALTUNG VON DNA MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN..................................................50
2.2.3.1.4
DEPHOSPHORYLIERUNG...........................................................................................
50
2.2.3.1.5
LIGATION..................................................................................................................
50
2.2.3.1.6
KLONIERUNG............................................................................................................
51
2.2.3.2 ISOLIERUNG VON D N A
....................................................................................................
51
2.2.3.2.1 PLASMID-DNA-PRAEPARATION AUS PROKARYOTISCHEN ZELLEN
...............................
51
2.2.3.2.1.1 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA IM ANALYTISCHEN MASSSTAB
.....................
51
2.2.3.2.1.1 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA IM PRAEPARATIVEN MASSSTAB
.....................
51
2.2.3.2.2 DNA-ISOLIERUNG AUS EUKARYOTISCHEN
ZELLEN....................................................51
2.2.3.2.2.1 PRAEPARATION VON VACCINIAVIRUS-DNA IM ANALYTISCHEN MASSSTAB
...........
51
2.2.3.2.2.1 PRAEPARATION VON VACCINIAVIRUS-DNA IM PRAEPARATIVEN MASSSTAB
...........
52
2.2.3.3 REINIGUNG VON
DNA....................................................................................................
52
2.2.3.3.1 PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION MIT ETHANOLPRAEZIPITATION
...............................
52
2.2.3.4
DNA-ANALYSE..............................................................................................................
53
2.2.3.4.1
AGAROSEGELELEKTROPHORESE.................................................................................53
2.2.3.4.2
SANGER-SEQUENZIERUNG......................................................................................
53
2 .2 .3 A 3 BIOINFORMATISCHE DATENAUSWERTUNG
................................................................
53
2.2.4 ARBEITEN MIT
RNA................................................................................................................53
2.2.4.1 RNA-ISOLIERUNG AUS
ZELLKULTURUEBERSTAENDEN............................................................
53
2.2.4.2 RNA-ISOLIERUNG AUS ZELLEN
.......................................................................................
54
2.2.4.3
REVERSE-TRANSKRIPTASE-PCR....................................................................................
54
2.2.4.4 /N-WFRO-TRANSKRIPTION (IV T
)........................................................................................54
2.2.4.5 AGAROSEGELELEKTROPHORESE VON R N A
......................................................................
55
2.2.4.6 5*-RAPID AMPLIFICATION OF CDNA ENDS (RACE)
......................................................
55
2.2.5 ARBEITEN MIT
VIREN..............................................................................................................
56
2.2.5.1 PORZINE
CORONAVIREN..................................................................................................56
2.2.5.1.1
TITERBESTIMMUNG..................................................................................................56
2.2.5.1.2
WACHSTUMSKURVEN..............................................................................................
56
2.2.5.2
VACCINIAVIREN...............................................................................................................
57
2.2.5.2.1 GENERIERUNG REKOMBINANTER
VACCINIAVIREN..................................................57
2.2.5.22
POSITIVSELEKTION.....................................................................................................57
2.2.52.3
NEGATIVSELEKTION...............................................................................................57
2.2.5.3 GENERELLER ABLAUF ZUR HERSTELLUNG REKOMBINANTER CORONAVIREN
(*RESCUE*) 59
2.2.6 HERSTELLUNG IM RAHMEN DIESER ARBEIT VERWENDETER VRECPEDVS UND
RECPEDVS....59
2.2.6.1 VERWENDETE PLASMIDE, AUSGANGS-VACCINIAVIREN, ENTSTANDENDE
VACCINIAVIREN
UND DARAUS RESULTIERENDE RECPEDVS
....................................................................................
59
2.2.8 EXPERIMENTELLE INFEKTION VON SPF-FERKELN
....................................................................
63
2.2.8.1 INFEKTION VON FERKELN MIT REKOMBINANTEN P E D V
S.................................................63
2.2 .82
PROBENAUSWERTUNG.......................................................................................
63
3
ERGEBNISSE....................................................................................................................................
65
3.1 ETABLIERUNG EINES REVERS-GENETISCHEN SYSTEMS FUER PEDV MINNESOTA
.............................
65
3.1.1 EINFUEHRUNG DER KOMPLETTEN PEDV-STAMM-MN-CDNA IN DAS
VACCINIAVIRUSGENOM.65
3.1.1.1 HERSTELLUNG DER SELEKTIONSPLASMIDE ZUR GENERIERUNG VON
VRECPEDV-MN
......
65
3.1.1.2 GENERIERUNG VON VRECPEDV-MN
.............................................................................
66
3.1.2 HERSTELLUNG EINER BHK-ZELLLINIE, DIE DAS N-PROTEIN VON PEDV MN
INDUZIERBAR
EXPRIMIERT.......................................................................................................................................69
3.1.3 HERSTELLUNG VON IN-VITRO-TRANSKRIBIERTER PEDV-MN-RNA UND
ELEKTROPORATION IN BHK-
PEDVWN-N-ZELLEN.........................................................................................................................
70
3.2 SUBSTITUTION VON SMN IN VRECPEDV-MN DURCH DAS S-GEN DES
ZELLKULTURADAPTIERTEN
STAMMES
CV777...............................................................................................................................71
3.3 HERSTELLUNG REKOMBINANTER PEDVS MIT SCW
77
DURCH AUSTAUSCH DER 5*UTR
MN
GEGEN
5*UTR
CV
777
.........................................................................................................................................
74
3.3.1 HERSTELLUNG EINES RECPEDV MIT 5*UTRC
V
777 UND SCV
77
7
...............................................
74
3.3.2 IDENTIFIZIERUNG VON NUKLEOTIDEN IN DER 5*UTR, WELCHE FUER EINE
ERFOLGREICHE
HERSTELLUNG REKOMBINANTER PEDVS ESSENTIELL
SIND.................................................................76
3.4 UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES VON ORF3 AUF DEN RESCUE REKOMBINANTER
PEDVS
.......
80
3.5 EINFLUSS VON SM
N
AUF DIE HERSTELLUNG UND IN-VITRO-KULTIVIERUNG REKOMBINANTER PEDVS .82
3.6 HERSTELLUNG REKOMBINANTER PEDVS MIT SM
N
DURCH EINFUEHRUNG SPEZIFISCHER MUTATIONEN84
3.6.1 AMINOSAEUREDIFFERENZEN ZWISCHEN SM
N
UND DEM S-PROTEIN IN-VITRO-KULTIVIERBARER
FELDSTAEMME..........................................................................
84
3.6.2 IDENTIFIZIERUNG VON AMINOSAEUREN IM S-PROTEIN MIT EINFLUSS AUF
EINEN ERFOLGREICHEN
RESCUE UND DIE IN-VITRO-KULTIVIERUNG REKOMBINANTER PEDVS
...............................................
85
3.6.3 EXAKTE BESTIMMUNG DER FUER RESCUE/IN-VITRO-KULTIVIERUNG VON
RECPEDVS
ESSENTIELLEN
AMINOSAEUREN..........................................................................................................
87
3.7 HERSTELLUNG REKOMBINANTER PEDVS FUER /N-V/VO-EXPERIMENTE
.............................................
89
3.7.1 GENERIERUNG VON
RECPEDV-MN-5*UTRCW77-SMNL375F,H486P.........................................90
3.7.2 HERSTELLUNG VON
RECPEDV-MN-5,UTRCV777-SCV777.........................................................92
3.7.3 HERSTELLUNG EINES RECPEDV MIT EINER DELETION IN ORF3 ZUR
UNTERSUCHUNG DES
EINFLUSSES VON GEN 3 AUF DIE VIRULENZ VON
PEDV..................................................................93
3.8 INFEKTION VON FERKELN MIT RECPEDVS .94
3.8.1 UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES DES S-PROTEINS AUF DIE VIRULENZ VON
PEDV IN VIVO..94
3.8.1.1 KLINISCHE BEURTEILUNG NACH INFEKTION VON FERKELN MIT RECPEDVS
MIT
UNTERSCHIEDLICHEN
S-GENEN....................................................................................................95
3.8.1.2 PATHOLOGISCHE UND HISTOPATHOLOGISCHE UNTERSUCHUNG INFIZIERTER
FERKEL
..........
96
3.8.1.3 UNTERSUCHUNG DES VIRUSGEHALTES IN TUPFER- UND BLUTPROBEN
..............................
99
3.8.1.4 NACHWEIS VON PEDV-RNA IN
ORGANPROBEN......................................................... 100
3.8.2 UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES VON GEN 3 AUF DIE VIRULENZ VON PEDV IN
VIVO
..
100
3.8.2.1 KLINISCHE BEURTEILUNG DES EINFLUSSES VON GEN 3 AUF DIE
PATHOGENESE DER PED
101
3.8.2.2 PATHOLOGISCHE UND HISTOPATHOLOGISCHE UNTERSUCHUNG INFIZIERTER
FERKEL ZUR
UNTERSUCHUNG VON GEN 3
......................................................................................................102
3.8.2.3 UNTERSUCHUNG DES VIRUSGEHALTES IN TUPFER- UND BLUTPROBEN
............................
102
3.8.2.4 NACHWEIS VON PEDV-RNA IN
ORGANPROBEN.........................................................103
4
DISKUSSION............................................................................................................................105
4.1 ETABLIERUNG EINES REVERS-GENETISCHEN SYSTEMS FUER EINEN
NORDAMERIKANISCHEN PEDV-
FELDSTAMM.......................................................................................................................................105
4.1.1 EINFLUSS DER PEDV-5*UTR-SEQUENZ AUF DIE HERSTELLUNG REKOMBINANTER
PEDVS .106
4.1.2 EFFEKT DES AUSTAUSCHES VON AMINOSAEUREN IN SM
N
AUF DIE HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
PEDVS...............................................................................................................108
4.2 CHARAKTERISIERUNG VON RECPEDV-MN IN
VIVO.......................................................................110
4.2.1 EINFLUSS DES S-PROTEINS AUF DIE VIRULENZ VON PEDV IN VIVO
.....................................
112
4.2.2 EINFLUSS VON ORF3 AUF DIE VIRULENZ VON PEDV IN VIVO
.............................................
113
4.3 VERWENDUNGSMOEGLICHKEITEN FUER DAS REVERS-GENETISCHE SYSTEM ZUR
HERSTELLUNG VON
RECPEDV-MN..................................................................................................................................
114
4.3.1 IDENTIFIZIERUNG VON BIOLOGISCHEN MARKERN UND GENEN MIT AUSWIRKUNG
AUF DIE
VIRULENZ VON
PEDV....................................................................................................................
114
4.3.2 EINSATZ REVERSER GENETIK ZUR VAKZINEHERSTELLUNG
......................................................
115
5
ZUSAMMENFASSUNG..............................................................................................................117
6
SUMMARY...............................................................................................................................119
7
LITERATURVERZEICHNIS............................................................................................................120
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