Vergleichende Untersuchung PCR-basierter Diagnostikverfahren für feline B-Zell-Lymphosarkome:
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| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
| Published: |
Gießen, Lahn
VVB Laufersweiler Verlag
2018
|
| Edition: | 1. Auflage |
| Series: | Edition Scientifique
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1 EINLEITUNG
...........................................................
1
2 LITERATURUEBERSICHT
............................................
2
2.1
LYMPHOSARKOM..........................................................................................2
2.1.1 DEFINITION UND
URSPRUNG.........................................................................2
2.1.2
KLASSIFIKATION..............................................................................................
2
2.1.2.1 MAKROSKOPISCHE
EINTEILUNG.....................................................................
2
2.1.2.1.1 ANATOMISCHE EINTEILUNG BEI DER
KATZE................................................... 3
2.1.2.2 HISTOLOGISCHE UND IMMUNHISTOLOGISCHE KLASSIFIKATION
.........
..............
4
2.1.2.2.1 WHO-KLASSIFIKATION DER IN DER ARBEIT VERWENDETEN NEOPLASIEN
....
7
2.1.3
AETIOLOGIE......................................................................................................
8
2.1.3.1 INFEKTIOESE G
ENESE.......................................................................................
8
2.1.3.1.1 FEBNES LEUKAEMIEVIRUS
(FELV)................................................................9
2.1.3.1.2 FELINES IMMUNDEFIZIENZ-VIRUS (FIV
)....................................................10
2.1.4
PROGNOSE....................................................................................................
10
2.1.5
DIAGNOSTIK.................................................................................................
11
2.1.5.1 EINSCHRAENKUNGEN DER HISTOLOGISCHEN UND IMMUNHISTOLOGISCHEN
DIAGNOSTIK.................................................................................................
11
2.1.5.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGSMETHODEN
................................
13
2.1.5.2.1
KLONALITAETSANALYSE....................................................................................13
2.1.5.2.2
B-ZELLEN.....................................................................................................
14
2.1.5.2.2.1
IMMUNGLOBULIN-STRUKTUREN...................................................................14
2.1.5.2.2.2 DIVERSITAET DES
ANTIKOERPERS.....................................................................18
2.1.5.2.2.2.1 V (D)
J-REKOMBINATION............................................................................
19
2.1.5.2.2.2.2 MECHANISMEN ZUR ERHOEHUNG DER ANTIKOERPERDIVERSITAET
...................
23
2.1.5.2.3
UNTERSUCHUNGSMETHODEN.........................................................................25
2.1.5.2.3.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE DIAGNOSTIKVERFAHREN IN DER
VETERINAERMEDIZINISCHEN
ONKOLOGIE.......................................................25
2.1.5.2.3.1.1
PROBENMATERIAL........................................................................................
27
2.1.5.2.3.1.1.1 EFFEKT DES FIXIERUNGSPROZESSES UND DER BEARBEITUNG VON
PROBEN
AUF DEN DNS-GEHALT UND DEREN INTEGRITAET
..........................................
27
2.1.5.2.3.1.2 SOUTHERN BLOT-HYBRIDISIERUNG (SBH )
.................................................
28
2.1.5.2.3.1.3 POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR).......................................................... 29
2.1.5.2.3.1.4 HIGH-RESOLUTION MELTING ANALYSIS (HRM )
.........................................
33
2.1.5.2.3.1.5 GENESCAN UND POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (PAGE)
................
39
2.1.5.2.3.1.5.1
HETERODUPLEXANALYSE..............................................................................41
3 MATERIAL UND M ETHODEN
.................................
42
3.1
UNTERSUCHUNGSMATERIAL..........................................................................
42
3.1.1
AUSGANGSMATERIAL....................................................................................
42
3.2 HISTOLOGISCHE UND IMMUNHISTOLOGISCHE
DIAGNOSE...............................42
3.3 BEARBEITUNG DES UNTERSUCHUNGSMATERIALS
..........................................
43
3.4 DNS-ISOLIERUNG AUS FORMALINFIXIERTEM UND IN PARAFFIN
EINGEBETTETEM
GEWEBE............................................................................
43
3.4.1 QUICKEXTRACT* FFPE DNA EXTRACTION K
IT.......................................43
3.4.2 KAPA EXPRESS
EXTRACT...........................................................................44
3.4.3 QIAAMP DNA FFPE TISSUE
KIT.........................................................44
3.5 DNS-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
.........................................................
47
3.5.1 PHOTOMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG.....................................47
3.6
DNASE-BEHANDLUNG........................................................................
48
3.7 DNS-VERDUENNUNG
...................................................................................
49
3.7.1 VERDUENNUNGSBERECHNUNG UND ERSTELLEN DER VERDUENNUNGEN
........
49
3.8 AMPLIFIKATION VON
NUKLEINSAEUREN........................................................ 49
3.8.1
DIAGNOSTIKPRIMER....................................................................................
49
3.8.2 HIGH-RESOLUTION MELTING ANALYSIS (H RM )
.........................................
50
3.8.2.1 BERECHNUNG DES MAXIMALEN
FLUORESZENZABFALLS.................................50
3.8.2.2 INTERKALIERENDER FLUORESZENZFARBSTOFF
................................................
52
3.8.2.2.1
EVAGREEN-FARBSTOFF..............................................................................52
3.8.3 POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR).........................................................53
3.8.3.1 MULTIPLEX-PCR FUER DIE HRM
................................................................ 53
3.8.4
GENESCAN..................................................................................................55
3.8.4.1 MULTIPLEX-PCR FUER DIE
KAPILLARELEKTROPHORESE.................................56
3.8.4.2
GERAETEAUFBAU...........................................................................................
58
3.8.4.2.1 ZUSCHNEIDEN DER
GLASKAPILLARE.............................................................58
3.8.4.2.2 VORBEREITUNG DES ABI PRISM 310 GENETIC ANALYZERS
.....................
58
3.8.4.2.3
PUFFERLOESUNG............................................................................................
59
3.8.4.2.4 STARTEN DES ABI PRISM 310 GENETIC
ANALYZERS.................................59
3.8.4.2.5 VORBEREITUNG DER PROBEN
......................................................................
60
3.8.4.2.6
PROBENLAUF...............................................................................................
61
3.8.4.2J
LAUFBEDINGUNGEN.....................................................................................
61
3.8.4.2.8
INJEKTIONSBEDINGUNGEN...........................................................................61
3.8.4.2.9 EINSATZ DES UNVERDUENNTEN
PCR-AMPLIFIKATS.....................................62
3.8.4.2.10 AUFREINIGUNG DER PCR-AMPLIFIKATE
....................................................
62
3.8.4.2.11
PROBENANALYSE.........................................................................................
62
3.8.5 POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (PAGE)
............................................
62
3.8.5.1
HETERODUPLEXANALYSE...............................................................................64
3.8.5.2 MODIFIKATION DER PAGE ZUR UEBERPRUEFUNG UNEINDEUTIGER
ERGEBNISSE.................................................................................................
65
3.9 ERGEBNISKONTROLLE
.....................................................................................
65
3.9.1 VISUALISIERUNG DER ERGEBNISSE
..............................................................
65
3.9.2
DNS-QUALITAETSKONTROLLE..........................................................................65
3.9.2.1 INTEGRITAETSKONTROLLE MITTELS
KONTROLLFRAGMENTEN................................65
3.9.2.2 AUFREINIGUNG VON
PCR-PRODUKTEN.......................................................67
4 ERGEBNISSE.........................................................68
4.1 GEWINNUNG DES FFPE-MATERIALS
..........................................................
68
4.2 MODIFIKATION DER
DIAGNOSTIKPRIMER..................................................... 68
4.2.1
LAENGENMODIFIKATION................................................................................
68
4.3 OPTIMIERUNG DER DNS-ISOLIERUNG
.........................................................
70
4.3.1 UNTERSCHIEDLICHE
ISOLIERUNGS-KITS........................................................70
4.4 OPTIMIERUNG DES
HRM-VERFAHRENS..................................................... 71
4.4.1
GRUNDFLUORESZENZ......................................................................................71
4.4.2
TEMPLATE-MENGE.....................................................................................
73
4.4.2.1 VERDUENNUNGSREIHE
...................................................................................
73
4.4.2.2 FESTLEGUNG DER EINGESETZTEN
TEMPLATE-MENGE....................................74
4.4.2.3 KONZENTRATIONSEINSTELLUNG DER ISOLIERTEN D N
S...................................76
4.4.3 ANZAHL DER Z
YKLEN..................................................................................
76
4.4.4
PRIMERKONZENTRATION..............................................................................78
4.4.5 EINGESETZTE
KONTROLLEN...........................................................................79
4.4.6 BERECHNUNG DES MAXIMALEN RELATIVEN FLUORESZENZABFALLS (FMAX). 81
4.5 OPTIMIERUNG DES
GENESCAN-VERFAHRENS..............................................82
4.5.1
TEMPLATE-MENGE.....................................................................................
82
4.5.2 GROESSENSTANDARD
......................................................................................
84
4.5.3 ANGEPASSTE
INJEKTIONSBEDINGUNGEN......................................................85
4.6 OPTIMIERUNG DES
PAGE-VERFAHRENS....................................................87
4.6.1
PRIMERMARKIERUNG..................................................................................
87
4.6.2
PCR-AMPLIFIKAT......................................................................................
88
4.6.3
MIDORI-GREEN-FARBSTOFF.........................................................................90
4.6.4
KUEHLUNG....................................................................................................92
4.7 EINTEILUNG DER UNTERSUCHTEN
PROBEN....................................................93
4.7.1
GRUPPENEINTEILUNG..................................................................................
93
4.8 AUSWERTUNG DER UNTERSUCHTEN
PROBEN...............................................125
4.8.1
B-ZELL-LYMPHOSARKOME.......................................................................125
4.8.2 POLYKLONALE
KONTROLLGRUPPE.................................................................129
4.8.2.1
FALLBEISPIELE............................................................................................
132
4.8.2.1.1 FALL
T8490/10..........................................................................................132
4.8.2.1.2 FALL
T4461/10..........................................................................................134
4.8.2.1.3 FOLLIKULAERE
HYPERPLASIEN......................................................................137
5 DISKUSSION.......................................................138
5.1 ZIEL DER
ARBEIT........................................................................................138
5.2 ZU BEACHTENDE KRITERIEN BEI DER ANWENDUNG
MOLEKULARBIOLOGISCHER DIAGNOSTIKVERFAHREN
....................................
138
5.2.1 PHASE DER
DNS-GEWINNUNG..................................................................139
5.2.1.1 GEWEBEENTNAHME AUS
PARAFFINBLOECKEN..............................................139
5.2.1.2 ISOLIERUNGSVERFAHREN UND
KONZENTRATIONSMESSUNG.........................139
5.2.1.3 EINFLUSS DES
FIXIERUNGSPROZESSES........................................................
140
5.2.2 PHASE DER AMPLIFIKATION UND SEPARATION
..........................................
142
5.2.2.1 POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)....................................................... 142
5.2.2.1.1 DIAGNOSTIKPRIMER
..................................................................................
142
5.2.2.1.2
REAKTIONSBEDINGUNGEN.........................................................................144
5.2.2.2 HIGH-RESOLUTION MELTING ANALYSIS (HRM)
........................................
146
5.2.2.3 POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (PAGE) MIT
HETERODUPLEXANALYSE............................................................................
147
5.2.2.4
GENESCAN.................................................................................................
149
5.2.2.4.1
PEAKHOEHE.................................................................................................
151
5.2.2.5 NEGATIVKONTROLLEN
..................................................................................
151
5.2.3 PHASE DER
ERGEBNISINTERPRETATION.......................................................152
5.2.3.1 EINTEILUNGSKRITERIEN FUER DIE UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE
..................
152
5.2.3.2 INTERPRETATION UND LIMITIERUNG DER KLONALITAETSANALYSE ZUM
NACHWEIS VON B-ZELL-LYMPHOSARKOMEN
...........................................
153
5.2.3.2.1 FALSCH-NEGATIVE
RESULTATE.....................................................................153
5.2.3.2.2 FALSCH-POLYKLONALE RESULTATE
..............................................................
155
5.2.3.2.3 FALSCH-POSITIVE
RESULTATE......................................................................156
5.2.3.2.4
PSEUDOKLONALITAET....................................................................................
156
5.2.3.2.5 OLIGOKLONALITAET
.......................................................................................
157
5.3 ANALYSE DER IN DEN VERSCHIEDENEN DIAGNOSTIKVERFAHREN
UNTERSUCHTEN
PROBEN.............................................................................
158
5.3.1 DISKUSSION DER UNTERSUCHUNGSERGEBNISSE
.........................................
158
5.3.1.1
B-ZELL-LYMPHOSARKOME.......................................................................158
5.3.1.2 POLYKLONALE KONTROLLGEWEBE
................................................................
159
5.3.1.3 BEDEUTUNG DES
DOPPELANSATZES...........................................................
160
5.4 VERGLEICH MIT BESTEHENDEN
DIAGNOSTIKVERFAHREN..............................161
5.5 BEURTEILUNG DER ANGEWANDTEN
DIAGNOSTIKVERFAHREN.......................165
5.6 BEURTEILUNG IM HINBLICK AUF DEN EINSATZ IN DER
ROUTINEDIAGNOSTIK..................................................................................167
6 ZUSAMMENFASSUNG
........................................
169
7 SUMMARY
........................................................
170
8 LITERATURVERZEICHNIS
.....................................
171
9 ANHANG
...........................................................
183
9.1
TABELLEN...................................................................................................
183
9.1.1 POLYKLONALE
KONTROLLGRUPPE.................................................................
183
9.1.2
B-ZELL-LYMPHOSARKOME.......................................................................185
9.2 VERWENDETE
LAENGENSTANDARDS.............................................................189
9.3 BEZUGSQUELLEN FUER LABORGERAETE UND
EINMALARTIKEL.........................189
9.4 BEZUGSQUELLEN FUER CHEMIKALIEN, ENZYME, KITS UND ANTIKOERPER.. 194
9.5 LOESUNGEN UND
PUFFER............................................................................
196
9.5.1
ELEKTROPHORESE.......................................................................................196
9.5.1.1 5 X T B E
.....................................................................................................
196
9.5.2
DNS-VERDUENNUNG...................................................................................
196
9.5.2.1 0,5 X T
RIS.................................................................................................
196
10 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS................................197
11 DANKSAGUNG....................................................202
12 ERKLAERUNG.......................................................204
13 ABBILDUNGSVERZEICHNIS.................................205
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| spelling | Scheffold, Svenja Verfasser (DE-588)1162861401 aut Vergleichende Untersuchung PCR-basierter Diagnostikverfahren für feline B-Zell-Lymphosarkome eingereicht von Svenja Scheffold 1. Auflage Gießen, Lahn VVB Laufersweiler Verlag 2018 V, 207 Seiten Illustrationen txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Edition Scientifique Dissertation Justus-Liebig-Universität Gießen 2018 cats cabt sarcoma cabt diagnostic techniques cabt polymerase chain reaction cabt Doktorarbeit Uni Wissenschaft (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=030850312&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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