Entwicklung, Charakterisierung und Anwendung eines kompartimentierten Mikroreaktorsystems zur automatisierten Durchführung magnetpartikelbasierter biochemischer Assays:
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Karlsruhe
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| adam_text | DANKSAGUNG V
ZUSAMMENFASSUNG VII
ABSTRACT IX
INHALT XI
ABBILDUNGEN XV
TABELLEN XVII
FORMELZEICHEN UND SYMBOLE XIX
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS XX
1 EINLEITUNG 1
2 GRUNDLAGEN UND STAND DER TECHNIK 3
2.1
MIKROFLUIDIK.............................................................................................................................
3
2.1.1
GRUNDLAGEN................................................................................................................
3
2.1.2 MIKROFLUIDIK IM SEGMENTIERTEN
FLUSS..........................................................................
6
2.2
MAGNETISMUS..........................................................................................................................
8
2.2.1 GRUNDLAGEN UND MAGNETISCHE KENNGROESSEN
..............................................................
8
2.2.2 MAGNETISCHE EIGENSCHAFTEN VON MATERIALIEN
..........................................................
11
2.2.3 HELMHOLTZ-SPULEN ZUR ERZEUGUNG VON MAGNETFELDERN
............................................
13
2.3 MAGNETISCHE
PARTIKEL............................................................................................................
14
2.3.1 AUFBAU, SYNTHESE UND FUNKTIONALISIERUNG
..............................................................
15
2.3.2 KRAEFTE AUF MAGNETPARTIKEL IN EINEM MAGNETFELD IN FLUIDISCHER
UMGEBUNG
...............
16
2.3.3 EINSATZGEBIETE UND
ANWENDUNGEN..........................................................................
19
2.4 SYSTEME ZUR HANDHABUNG VON
MAGNETPARTIKELN..................................................................22
2.4.1 PIPETTIERROBOTER UND AUTOMATISIERTE LIQUID HANDLING SYSTEME
..................................
22
2.4.1.1 EIGENSCHAFTEN UND OPTIMIERUNGEN ZUR MAGNETPARTIKELHANDHABUNG
.....
22
2.4.1.2 EINSATZLIMITIERUNGEN VON AUTOMATISIERTEM
LIQUID HANDLING
.......................
24
2.4.2 MIKROFLUIDISCHE
PARTIKELVERARBEITUNGSVERFAHREN......................................................
25
2.4.2.1 KONZEPTE ZUR
MAGNETPARTIKELKONTROLLE....................................................
25
2.4.2 2 MAGNETPARTIKELKONTROLLE IM SEGMENTIERTEN
FLUSS....................................30
3 MATERIAL UND METHODEN 33
3.1 MESSINSTRUMENTE UND
GERAETE...............................................................................................33
3.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN UND
LABORZUBEHOER...........................................................................34
3.3
CHEMIKALIEN..........................................................................................................................34
3.4
MAGNETPARTIKEL......................................................................................................................35
3.5
SOFTWARE...............................................................................................................................36
3.6
PARTIKELCHARAKTERISIERUNG.....................................................................................................
36
3.6.1 GRAVIMETRISCHE
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG...........................................................37
3.6.2 OBERFLAECHENGEWICHTETER PARTIKELDURCHMESSER UND
PARTIKELGROESSENVERTEILUNG
.........
37
3.6.3 ANALYSE DER ZUSAMMENSETZUNG DER
KOMPOSITPARTIKEL............................................ 38
3.6.4 PARTIKELVOLUMEN, DICHTEN UND
MASSEN....................................................................39
3.6.5 OBERFLAECHENCHARAKTERISIERUNG MITTELS ESEM
...........................................................
40
3.6.6 MAGNETISCHE CHARAKTERISIERUNG
..............................................................................
41
3.7 CHARAKTERISIERUNG DER MAGNETSYSTEME
................................................................................
41
3.7.1
ELEKTROMAGNETFELD....................................................................................................41
3.7.2
PERMANENTMAGNETFELD..............................................................................................42
3.8 CHARAKTERISIERUNG DER SEGMENTIERTEN FLUIDKOMPARTIMENTE
..................................................
44
3.8.1
DOSIERGENAUIGKEIT.....................................................................................................44
3.8.2
POSITIONIERGENAUIGKEIT..............................................................................................48
3.8.3
FLUIDVERSCHLEPPUNG..................................................................................................49
3.8.4
WASCHFAKTORBERECHNUNG..........................................................................................51
3.9 RESUSPENDIERBARKEIT DER PARTIKEL IM
SYSTEM........................................................................51
3.10
PARTIKEL-SEPARATIONSEFFIZIENZ.................................................................................................53
3.11 ENZYMIMMOBILISIERUNG MIT
EDC...........................................................................................
55
3.11.1
IMMOBILISIERUNGSREAKTIONEN.....................................................................................56
3.11.2 BERECHNUNG DER IMMOBILISIERUNGSAUSBEUTE
............................................................
57
3.11.3 AKTIVITAET DER
ENZYMIMMOBILISATE..............................................................................57
3.12 DNA-AUFREINIGUNG IM REAKTORSYSTEM
..................................................................................
61
3.12.1 HUMANES VOLLBLUT ALS PROBENMATERIAL
.....................................................................
61
3.12.2 AUTOMATISIERTER DNA-AUFREINIGUNGSPROZESS IM REAKTOR
.........................................
62
3.13 GAPDH-GENFRAGMENTAMPLIFIKATION VIA POLYMERASE-KETTENREAKTION
....................................
65
3.14
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE..................................................................................................66
3.15
SDS-PAGE............................................................................................................................66
4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 69
4.1 AUFBAU DES
REAKTORSYSTEMS.................................................................................................69
4.1.1 DAS FLUIDISCHE PERIPHERIESYSTEM
.............................................................................
70
4.1.2 DAS MAGNETFELDMODUL
............................................................................................
74
4.1.2.1 AUFBAU UND ALLGEMEINE
BESCHREIBUNG.....................................................75
4.1.2.2
BETRIEBSMODI............................................................................................77
4.1.2.3 INTEGRATION IN DIE ZENTRALE REAKTORSTEUERUNG
............................................
30
4.2 ALLGEMEINES FUNKTIONSPRINZIP DES REAKTORSYSTEMS
.............................................................
83
4.3 CHARAKTERISIERUNG DES REAKTORSYSTEMS
...............................................................................
86
4.3.1
MAGNETSYSTEME........................................................................................................86
4.3.1.1
ELEKTROMAGNETFELD....................................................................................
87
4.3.1.2
PERMANENTMAGNETFELD..............................................................................
88
4.3.2 CHARAKTERISIERUNG DER SEGMENTIERTEN
FLUIDKOMPARTIMENTE.......................................92
4.3.2.1
DOSIERGENAUIGKEIT....................................................................................
92
4.3.22
FLUIDVERSCHLEPPUNG..................................................................................
95
4.3.2.3
WASCHFAKTOREN.........................................................................................99
4.3.2.4
POSITIONIERGENAUIGKEIT............................................................................
101
4.3.3
PARTIKELPROZESSIERUNG.............................................................................................103
4.3.3.1
PARTIKELCHARAKTERISIERUNG.......................................................................
103
4.3.3.2
RESUSPENDIERUNGSEFFIZIENZ....................................................................
107
4.3.3.3 ALLGEMEINE SEPARATIONSEFFIZIENZ
...........................................................
114
4.3.3.4 EINFLUSSPARAMETER AUF DIE
SEPARATIONSEFFIZIENZ.....................................115
4.4 ANWENDUNG I - ENZYMKINETIK UND
REZYKLIERUNG................................................................
119
4.4.1
REAKTORKONFIGURATION...............................................................................................119
4.4.2 IMMOBILISATAKTIVITAET NACH SEPARATIONSFLUIDEXPOSITION
............................................
121
4.4.3 AKTIVITAET IMMOBILISIERTER HRP - KINETISCHE UNTERSUCHUNGEN IM
REAKTORSYSTEM... 122
4.4.4 RECYCLING IMMOBILISIERTER HRP IM REAKTORSYSTEM
................................................
124
4.4.5
FAZIT.......................................................................................................................
125
4.5 ANWENDUNG II - AUTOMATISIERTE DNA-AUFREINIGUNG AUS HUMANEM VOLLBLUT
........................
126
4.5.1 ANWENDUNGSBEZOGENE REAKTORKONFIGURATION
.......................................................
128
4.5.2 ERGEBNISSE DER
DNA-AUFREINIGUNG.......................................................................132
4.5.3
PROZESSCHARAKTERISIERUNG......................................................................................
137
4.5.3.1 EINFLUSS DER ELEKTROMAGNETISCHEN RESUSPENDIERUNG
............................
137
4.5.3.2
MAGNETPARTIKELMENGE............................................................................
139
4.5.3.3 ANZAHL DER WASCHZYKLEN
.......................................................................
140
4.5.4
SYSTEMREINIGUNG....................................................................................................
141
4.5.5
FAZIT.......................................................................................................................
143
5 GESAMTFAZIT UND AUSBLICK 145
LITERATURVERZEICHNIS 149
ANHANG 157
A MAPLE PROGRAMM ZUR MAGNETFELDBERECHNUNG EINER
HELMHOLTZ-SPULE..........................157
B FIJI-MAKROS ZUR QUANTIFIZIERUNG DER KOMPARTIMENTFLAECHEN
..........................................
158
C KONSTRUKTIONSSKIZZEN WICHTIGER KOMPONENTEN DES
MAGNETFELDMODULS........................160
D SCHALTPLAN DER MAGNETFELDMODUL STEUERUNG
................................................................
162
E
ARDUINO-CODE...............................................................................................................
162
F BEISPIELHAFTES QMIXELEMENTS
SKRIPT.............................................................................166
AKADEMISCHER LEBENSLAUF 167
PUBLIKATIONEN 168
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