Die Rolle des Ubiquitin-Proteasom-Systems in den späten Prozessen der HIV-1 Replikation:
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
1.
ZUSAMMENFASSUNG............................................................................................................................1
2.
EINLEITUNG...........................................................................................................................................
3
2.1. DAS HUMANE IMMUNDEFIZIENZ-VIRUS TYP 1
(HIV-1)................................................................................3
2.2. MORPHOLOGIE UND GENOMORGANISATION VON H IV
-1................................................................................4
2.3. DER HIV-1
REPLIKATIONSZYKLUS....................................................................................................................
5
2.4. DIE ROLLE DES PR55 GAG-POLYPROTEINS IN DEN SPAETEN PROZESSEN DES
HIV-1 REPLIKATIONSZYKLUS... 7
2.5. DAS
UBIQUITIN-PROTEASOM-SYSTEM...........................................................................................................
9
2.6. MHC-I
ANTIGENPRAESENTATION....................................................................................................................
11
2.7. DEUBIQUITINYLIERENDE
ENZYME................................................................................................................13
2.8. DIE ROLLE VON DUBS IN DER
PATHOGENESE...............................................................................................14
2.9. DUBS IN VIRALEN
INFEKTIONEN....................................................................................................................
15
2.10. DUB-INHIBITOREN
(DIS)..............................................................................................................................
16
3.
ERGEBNISSE........................................................................................................................................
17
3.1. DIE GLUTAMINSAEUREN IN HIV-1 P6 REGULIEREN DIE VIRUSFREISETZUNG UND
DIE MEMBRANASSOZIATION
VON
GAG.......................................................................................................................................................
17
3.1.1. DIE MUTATION DER GLUTAMINSAEUREN IN P6 FUEHRT ZU EINEM DEFEKT IN
GAG-PROZESSIERUNG UND
VIRUSFREISETZUNG...............................................................................................................................
17
3.1.2. DIE MUTATION DER GLUTAMINSAEUREN IN P6 FUEHRT ZU EINER VERRINGERTEN
INFEKTIOSITAET UND
REPLIKATIONSKAPAZITAET VON
HIV-1...................................................................................................23
3.1.3. DER FREISETZUNGSDEFEKT DER EOA-MUTANTE KANN DURCH UEBEREXPRESSION
VON ALIX NICHT
REVERTIERT
WERDEN.............................................................................................................................25
3.1.4. DIE GLUTAMINSAEUREN IN P6 VERMITTELN DEN EINTRITT VON GAG IN DAS
UPS...............................27
3.1.5. EINFLUSS DER GLU-MUTATIONEN AUF DIE STRUKTUR VON
P6...............................................................30
3.1.6. DIE MUTATION DER GLUTAMINSAEUREN IN P6 FUEHRT ZU EINER VERSTAERKTEN
MEMBRANASSOZIATION
VON
GAG..............................................................................................................................................32
3.1.7. DIE EOD-MUTANTE HAT WT-PHAENOTYP: DIE NEGATIVEN LADUNGEN IN P6,
ABER NICHT DIE ART DER
SEITENKETTEN REGULIEREN DIE MEMBRANASSOZIATION VON GAG
...................................................
34
3.2. INHIBITOREN DEUBIQUITINYLIERENDER ENZYME BLOCKIEREN DIE HIV-1
REPLIKATION UND ERHOEHEN DIE
MHC-I ANTIGENPRAESENTATION GAG-ABSTAMMENDER EPITOPE
.............................................................
36
3.2.1. DIE DUB-INHIBITOREN P22077 UND PR-619 VERMINDERN DIE
PROZESSIERUNG VON HIV-1 GAG
OHNE DABEI DIE AKTIVITAET DER VIRALEN PROTEASE ZU BEEINFLUSSEN
.............................................
36
3.2.2. DIE DUB-INHIBITOREN P22077 UND PR-619 VERRINGERN DIE
INFEKTIOSITAET VON H IV -1
..............
39
3.2.3. DIE DUB-INHIBITOREN P22077 UND PR-619 VERRINGERN DIE
REPLIKATIONSKAPAZITAET VON
H IV
-1..................................................................................................................................................40
3.2.4. DIE DUB-INHIBITOREN PR-619 UND P22077 STEIGERN DEN EINTRITT VON
GAG IN DAS UPS UND
VERSTAERKEN DAMIT DIE MHC-I ANTIGENPRAESENTATION VON G
AG....................................................47
4.
DISKUSSION..........................................................................................................................................
50
4.1. DIE GLUTAMINSAEUREN IN HIV-1 P6 REGULIEREN DIE VIRUSFREISETZUNG UND
DIE MEMBRANASSOZIATION
VON
GAG........................................................................................................................................................
50
4.2. INHIBITOREN VON DEUBIQUITINYLIERENDEN ENZYMEN BLOCKIEREN DIE HIV-1
REPLIKATION UND
ERHOEHEN DIE MHC-I ANTIGENPRAESENTATION GAG-ABSTAMMENDER EPITOPE
.......................................
55
5. M ATERIAL UND M E TH O D EN
.................................................................................................................60
5.1. M
ATERIAL.......................................................................................................................................................
60
5.1.1. BAKTERIEN UND
BAKTERIENKULTURREAGENZIEN...................................................................................60
5.1.2. EUKARYOTISCHE ZELLEN UND
ZELLKULTURREAGENZIEN..........................................................................60
5.1.3. PLASMIDE UND
VIRUSISOLATE...............................................................................................................
62
5.1.4.
OLIGONUKLEOTIDE.................................................................................................................................
63
5.1.5. ANTISEREN UND
ANTIKOERPER...............................................................................................................
65
5.1.6.
INHIBITOREN.........................................................................................................................................
66
5.1.7. PUFFER UND
LOESUNGEN........................................................................................................................
66
5.1.8. SYNTHETISCHE
PEPTIDE.......................................................................................................................
68
5.2. M
ETHODEN...................................................................................................................................................
69
5.2.1. POSITIONSGERICHTETE
MUTAGENESE..................................................................................................
69
5.2.2. TRANSFORMATION UND ANZUCHT VON
BAKTERIEN...............................................................................
69
5.2.3. ISOLATION VON PLASMID-DNA UND BESTIMMUNG DER DNA-KONZENTRATION
................................
69
5.2.4.
DNA-SEQUENZIERUNG.........................................................................................................................
70
5.2.5. KULTIVIERUNG VON EUKARYOTISCHEN ZELLLINIEN
.................................................................................
70
5.2.6. KULTIVIERUNG UND PRAEPARATION VON HUMANEN
PRIMAERZELLEN......................................................70
5.2.7. TRANSFEKTION VON
PLASMID-DNA......................................................................................................71
5.2.8.
ZELLLYSE................................................................................................................................................71
5.2.9. PELLETIERUNG VON
VLPS......................................................................................................................71
5.2.10. SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (PAGE)
..........................................................................
72
5.2.11. WESTERN BLOT UND DENSITOMETRISCHE
AUSWERTUNG.....................................................................72
5.2.12. DURCHFUEHRUNG EINER
FREISETZUNGSKINETIK......................................................................................73
5.2.13. IN VITRO PROZESSIERUNG DES PR55
GAG-POLYPROTEINS.....................................................................73
5.2.14. NACHWEIS VON UBIQUITINYLIERTEM GAG MITTELS IMMUNPRAEZIPITATION
........................................
73
5.2.15.
DURCHFLUSSZYTOMETRIE.......................................................................................................................74
5.2.16. HERSTELLUNG VON
VIRUSSTOCKS............................................................................................................74
5.2.17. BESTIMMUNG DER VIRUSKONZENTRATION MITTELS P24-ELISA
..........................................................
75
5.2.18. UNTERSUCHUNG DER INFEKTIOSITAET MITTELS SINGLE-ROUND
INFEKTIONSASSAYS
5.2.19. INFEKTION VON
HLACS.........................................................................................................................75
5.2.20. MESSUNG DER REVERSEN
TRANSKRIPTASE-AKTIVITAET..........................................................................
76
5.2.21.
ZELLVIABILITAETS-ASSAY..........................................................................................................................76
5.2.22. MEMBRANE FLOTATION
ASSAY............................................................................................................
76
5.2.23.
NMR-SPEKTROSKOPIE........................................................................................................................
77
6.
LITERATURVERZEICHNIS.......................................................................................................................78
7.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS..................................................................................................................90
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