Holdings: Identifizierung der Zielgene der Micro-RNA-126 in humanen Osteoblasten

Identifizierung der Zielgene der Micro-RNA-126 in humanen Osteoblasten:

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Main Author:	Nabar, Nikita (Author)
Format:	Thesis Book
Language:	German
Published:	Freiburg im Breisgau [2018]
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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS 1. EINLEITUNG..........................................................................................................................................1 1.1. TISSUE ENGINEERING............................................................................................................................... 1 1.1.1 .DEFINITION UND ALLGEMEINE DENKANSAETZE............................................................................................. 1 1.1.2. EXPERIMENTELLE VERFAHRENSWEISE.......................................................................................................2 1.1.3. AKTUELLE KNOCHENERSATZTHERAPIEN UND DIE RELEVANZ VON TISSUE ENGINEERING KONSTRUKTEN...........3 1.2. BIOLOGIE DES KNOCHENS....................................................................................................................... 6 1.2.1. ANATOMIE..............................................................................................................................................6 1.2.2. KNOCHENENTSTEHUNG - DESMALE UND CHONDRALE OSSIFIKATION ............................................................. 8 1.2.3. MODELLING UND REMODELLING DES KNOCHENS ...................................................................................... 9 1.2.4. FRAKTUR UND KNOCHENHEILUNG........................................................................................................... 10 1.3. NEOVASKULARISATION.............................................................................................................................11 1.3.1. VASKULOGENESE UND ANGIOGENESE.................................................................................................... 11 1.3.2. NEOVASKULARISATION VON TISSUE ENGINEERING KONSTRUKTEN..............................................................12 1.3.3. INTERAKTIONEN ZWISCHEN ENDOTHELZELLEN UND OSTEOBLASTEN..............................................................12 1.4. GENREGULATION DURCH MICRO-RNAS...................................................................................................17 1.4.1. DEFINITION UND ENTDECKUNG VON MICRO-RNAS ................................................................................ 17 1.4.2. MORPHOLOGIE UND METABOLISMUS...................................................................................................... 18 1.4.3. DIE RELEVANZ VON MIRNAS IN DER HEUTIGEN MEDIZIN....................................................................19 1.4.4. MICRO-RNAS IM KNOCHENSTOFFWECHSEL........................................................................................... 20 1.4.5. MICRO-RNA-126 - AKTUELLER WISSENSSTAND UND NACHGEWIESENE ZIEL-MRNAS ............................ 21 2. ZIELE DER DISSERTATIONSARBEIT.........................................................................................26 3. MATERIAL UND METHODEN....................................................................................................... 27 3.1. ZELLKULTUR.............................................................................................................................................. 27 3.1.1. ISOLIERUNG UND KULTIVIERUNG VON HUMANEN OSTEOBLASTEN .............................................................. 28 3.1.2. KULTIVIERUNG VON HUMANEN UMBILIKALVENOESEN ENDOTHELZELLEN...................................................... 30 3.1.3. KRYOKONSERVIERUNG UND AUFTAUEN VON ZELLEN................................................................................ 30 3.1.4. SPLITTEN UND PASSAGIEREN VON ZELLEN................................................................................................32 3.2. UNTERSUCHUNGEN DER ENDOGENEN UEBEREXPRESSION DER MIR-126 IN HUMANEN OSTEOBLASTEN NACH KOKULTUR UND EXOGENEN UEBEREXPRESSION NACH TRANSFEKTION MITTELS TAQMAN-RT-PCR ..................... 33 3.2.1 KOKULTIVERUNG VON HOBS UND HUVECS MIT DIREKTEM ZELLKONTAKT...............................................33 3.2.2. NEGATIVE IMMUNOMAGNETISCHE SEPARATION MIT ANTI-CD-31 DYNABEADS ....................................... 34 3.2.3. TRANSFEKTION VON HUMANEN OSTEOBLASTEN MIT MIRNA....................................................................35 3.2.4. AUSPLATTIEREN DER TRANSFIZIERTEN ZELLEN ............................................................................................ 37 3.2.5. RNA-ISOLIERUNG MITTELS MIRVANA* MIRNA ISOLATION K IT.............................................................38 3.2.6. CDNA-SYNTHESE UND REVERSE TRANSKRIPTION DER MIRNA................................................................39 3.2.7. CDNA-SYNTHESE UND REVERSE TRANSKRIPTION DER PRI-MIR-126 ........................................................ 40 3.2.8. TAQMAN-RT-PCR...........................................................................................................................41 3.3. AFFYMETRIX CDNA MICROARRAY............................................................................................................ 42 3.3.1. RNA-ISOLIERUNG MITTELS RNEASY MINI K IT................................................................................... 43 3.3.2. DURCHFUEHRUNG DER MICROARRAYS........................................................................................................ 45 3.4. UNTERSUCHUNG DER DIFFERENTIELLEN GENEXPRESSION MITTELS RT-QPCR MIT SYBR-GREEN ............... 47 3.4.1. DNASE-I-VERDAU...............................................................................................................................47 3.4.2. CDNA-SYNTHESE UND REVERSE TRANSKRIPTION (MRNA).....................................................................48 3.4.3. RT-QPCR MIT SYBR GREEN.......................................................................................................... 49 3.4.4. STATISTISCHE AUSWERTUNG....................................................................................................................53 3.5. LUCIFERASE-ASSAY.................................................................................................................................. 54 4. ERGEBNISSE....................................................................................................................................... 56 4.1. ERGEBNIS DER TAQMAN-RT-PCR ZUR UNTERSUCHUNG DER ENDOGENEN UEBEREXPRESSION VON MIR-126 IN KOKULTIVIERTEN OSTEOBLASTEN....................................................................................................................56 4.2. ERGEBNIS DER TAQMAN-RT-PCR ZUR MIRNA-EXPRESSION IN TRANSFIZIERTEN OSTEOBLASTEN............58 4.3. ERGEBNIS DER MICROARRAY DATENANALYSE UND DARSTELLUNG DER PRAEDIZIERTEN ZIELGENE ....................... 59 4.4. LITERATURRECHERCHE UND GO-ANALYSE...................................................................................................67 4.5. VALIDIERUNG DER MICROARRAY-DATEN..................................................................................................... 73 4.5.1. ERGEBNISSE DER SYBR GREEN RT-QPCR DER POTENTIELLEN ZIEL-MRNAS VON MIR-126..............73 4.5.2. CAMSAP1 -MRNA ALS VALIDIERTES TARGET DER MIR-126.................................................................75 4.5.3 ERGEBNIS DES LUCIFERASE-REPORTER-ASSAYS FUER CAMSAP 1 ............................................................. 76 4.5.4. RT-QPCR DER GENE MIT BETEILIGUNG AM INSULIN-SIGNALWEG .......................................................... 77 5. DISKUSSION ..... . ................................................................................................................................. 79 5.1. UNTERSUCHUNG DER ENDOGENEN UEBEREXPRESSION VON MIR-126 IN KOKULTIVIERTEN OSTEOBLASTEN ....... 80 5.2. TRANSAKTION VON HUMANEN OSTEOBLASTEN: MIR-126-UEBEREXPRESSION UND INHIBITION ..................... 80 5.3. EXPERIMENTELLE VALIDIERUNG VON MIRNA-ZIELGENEN......................................................................... 81 5.4. DEUTUNG DER MICROARRAY-ERGEBNISSE: MIR-126 BEEINFLUSST EINIGE OSTEOBLASTEN-RELEVANTE TRANSKRIPTE...................................................................................................................................................84 5.5. CAMSAP 1 -MRNA WIRD DURCH DIREKTE BINDUNG VON MIR-126 REGULIERT.........................................88 5.6. INSULIN-GENE/PI3K-SIGNALKASKADE......................................................................................................90 5.7. AUSBLICK............................................................................................................................................... 93 6. ZUSAMMENFASSUNG 94 7. LITERATURVERZEICHNIS.............................................................................................................95 8. ANHANG.............................................................................................................................................. 109 8.1. DANKSAGUNG.........................................................................................................................................109 8.2. PUBLIKATION..........................................................................................................................................110 8.3. EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG...................................................................................................................111 8.4. 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