Iconoclastic Ginna: futurism, science and total art
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[2018]
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS IV
ABBILDUNGSVERZEICHNIS VII
TABELLENVERZEICHNIS VIII
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS IX
1 EINLEITUNG 1
1.1 DIE HAEMATOPOESE 1
1.2 MYELOPROLIFERATIVE ERKRANKUNGEN /
NEOPLASIEN 6
1.2.1 POLYCYTHAEMIA VERA - PV 8
1.2.2 ESSENTIELLE THROMBOZYTOSE - ET 9
1.2.3 PRIMAERE MYELOFIBROSE - PMF 10
1.2.4 MOLEKULARBIOLOGISCHE VERAENDERUNGEN BEI MYELOPROLIFERATIVEN
NEOPLASIEN 11
1.3 NUCLEAR FACTOR ERYTHROID 2 -
NF-E2 15
1.3.1 NF-E2 - MOLEKULARE ASPEKTE 16
1.3.2 MECHANISMEN DER NF-E2-FUNKTION 18
1.3.3 BEKANNTE ZIELGENE VON NF-E2 18
1.4 FRAGESTELLUNG UND ZIEL DER ARBEIT 20
2 MATERIAL UND METHODEN 21
2.1 VERVIELFAELTIGUNG VON DNA
IN BAKTERIEN 21
2.1.1 TRANSFOMATION VON DNA IN KOMPETENTE ESCHERICHIA COLI 21
2.1.2 KOLONIE PCR VON BAKTERIELLEN KOLONIEN 21
2.1.3 SCHNELLPRAEPARATION VON DNA AUS BAKTERIEN 23
2.1.4 PRAEPARATIVE DNA-AUFREINIGUNG AUS BAKTERIEN (MAXI-PREP) 24
2.1.5 KONSERVIERUNG VON BAKTERIEN 24
2.1.6 BESTIMMUNG DER DNA-KONZENTRATION MITTELS NANODROP-MESSUNG 25
2.1.7 DNA SEQUENZIERUNG 25
2.2 ENZYMATISCHE MANIPULATION VON DNA 26
2.2.1 HYDROLYSE VON DNA MITTELS RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 26
2.2.2 AMPLIFLKATION VON DNA-ELEMENTEN MITTELS PCR 27
2.2.3 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-ENDEN 28
2.2.4 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 28
2.2.5 ERSTELLUNG VON MUTATIONEN MITTELS *GENEARTSITE-DIRECTED
MUTAGENESIS SYSTEM 29
2.3 TRENNUNG UND REINIGUNG VON DNA 30
2.3.1 AGAROSEGELELEKTROPHORESE 30
2.3.2 EXTRAKTION VON DNA AUS AGAROSE (QIAGEN) 30
2.3.3 PRAEZIPITATION VON DNA 31
2.4 ZELLLINIEN 32
2.4.1 KULTIVIERUNG UND KONSERVIERUNG 32
2.4.2 HEK 293T-ZELLEN 34
2.4.3 NIH/3T3-ZELLEN 34
2.4.4 H EL*ZELLEN 34
2.4.5 UKE-1*ZELLEN 35
2.4.6 SET-2-ZELLEN 35
2.4.7 U937-ZELLEN 35
2.4.8 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL (NEUBAUER-ZAEHLKAMMER) 35
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INHALTSVERZEICHNIS V
2.5 POLYACRYLAMID GELELEKTROPHORESE UND WESTERN BLOT 36
2.5.1 PROTEINEXTRAKTION 36
2.5.2 REDUKTION UND ALKYLIERUNG DER PROTEINE 36
2.5.3 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION MITTELS BRADFORD-ASSAY 37
2.5.4 DISKONTINUIERLICHE SDS-POLYACRYLAMID GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE)
38
2.5.5 WESTERN BLOT (TANKBLOT-VERFAHREN) 39
2.5.6 ANTIGENNACHWEIS DURCH IMMUNKOMPLEXDETEKTION 40
2.5.7 ENTFERNEN GEBUNDENER ANTIKOERPERKOMPLEXE (STRIPPING) 41
2.6 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 42
2.6.1 ANALYSE VON ZELLPOPULATIONEN DURCH BESTIMMUNG DER ZELLGROESSE UND
GRANULARITAET 42
2.6.2 ANALYSE VON
GFP-EXPRIMIERENDEN ZELLEN 43
2.6.3 FACS-ZELL-SORTIERUNG 43
2.6.4 EXTRAZELLULAERE FAERBUNG VON CD34-OBERFLAECHENPROTEINEN 43
2.6.5 INTRAZELLULAERE FAERBUNG VON IL-8-PROTEINEN 45
2.7
IL
-8-
EUSA-M
ESSUNG 46
2.8 PRODUKTION UND TITRATION
LENTIVIRALER PARTIKEL 46
2.8.1 PRODUKTION LENTIVIRALER PARTIKEL 46
2.8.2 TITRATION LENTIVIRALER PARTIKEL 49
2.9 ISOLIERUNG VON CD34+
-ZELLEN AUS PERIPHEREM SPENDERBLUT 51
2.9.1 AUFREINIGUNG MONONUKLEAERER ZELLEN 51
2.9.2 ISOLIERUNG DER CD34+ ZELLEN 52
2.10 KULTIVIERUNG UND LENTIVIRALE TRANSDUKTION HUMANER CD34
+
-ZELLEN 54
2.11 QUANTITATIVE PCR ZUM NACHWEIS VON
HUMANEM NF-E2
UND IL-8 55
2.11.1 ISOLATION VON RNA MITTELS SILICAGEL-MEMBRAN (RNEASY, INVITROGEN)
55
2.11.2 REVERSE TRANSKRIPTION VON RNA 55
2.11.3 TAQMAN QUANTITATIVE REAL-TIME PCR (QRT-PCR) 56
2.12 AFFYMETRIX-MICROARRAY 60
2.12.1 RNA-ISOLATION 60
2.12.2 BESTIMMUNG DER RNA-QUALITAET (AGILENT RNA 6000 NANO ASSAY) 60
2.12.3 RIBO-MINUS-KIT 61
2.12.4 PROZESSIERUNG DER RNA-PROBEN 62
2.12.5 HYBRIDISIERUNG DER PROBEN AUF EXON-CHIPS 63
2.12.6 WASCHEN, MARKIEREN UND AUSLESEN DER CHIPS 63
2.13 DATENANALYSE DER ERGEBNISSE AUS DER MICROARRAY-ANALYSE 64
2.13.1 NORMALISIERUNG, KONDENSIERUNG UND FILTERUNG DER ROHDATEN 64
2.13.2 DATENPROZESSIERUNG UND BESTIMMUNG DIFFERENZIELLEN EXPRESSION 64
2.13.3 DATENPROZESSIERUNG UND BESTIMMUNG ALTERNATIVEN SPLEISSENS AUF
EXON-EBENE 65
2.14 LUCIFERASE-ASSAY 66
2.15 STATISTISCHE ANALYSEN UND WEITERE SOFTWARE 68
2.16 VERWENDETE OLIGONUKLEOTIDE 68
2.17 VERWENDETE OLIGONUKLEOTIDE 69
3 ERGEBNISSE 70
3.1 ETABLIERUNG EINER ALTERNATIVEN QUELLE FUER CD34
+
-ZELLEN 70
3.2 KLONIERUNG UND ETABLIERUNG DER LENTIVIRALEN-KONSTRUKTE ZUR
MODULATION DER NF-E2-EXPRESSION
75
3.2.1 KLONIERUNG DES HUMANEN U6-PROMOTERS IN DEN LEGO-IG-VEKTOR 77
3.2.2 INTEGRATION DER CDNA FUER NF-E2 IN DEN PIG-HU6-VEKTOR 78
3.2.3 INTEGRATION DER SHRNA GEGEN NF-E2 IN DEN PIG-HU6-VEKTOR 79
3.2.4 PRODUKTION UND TITRATION DER PIG-U6-LENTIVIREN 80
3.2.5 NACHWEIS DER FUNKTIONALITAET DER NEUEN PIG-HU6-LENTIVIREN 83
VI INHALTSVERZEICHNIS
3.3 MODULATION DER NF-E2-EXPRESSION IN CD34
+
-HAEMATOPOETISCHEN
STAMMZELLEN 85
3.3.1 INFEKTION, SORTIERUNG UND RNA-EXTRAKTION DER CD34*-ZELLEN 86
3.3.2 QUANTITATIVE NF-E2-MESSUNG IN DEN SELEKTIONIERTEN CD34*- ZELLEN 88
3.4 MICROARRAY-ANALYSE 90
3.4.1 DIFFERENTIELL EXPRIMIERTE GENE DURCH MODULATION VON NF-E2 90
3.4.2 ANALYSE DES
DURCH NF-E2 BEDINGTEN ALTERNATIVEN SPLICINGS 91
3.5 VERIFIZIERUNG DER REGULATION VON IL-8 DURCH DIE MODULATION
DER
NF-E2-EXPRESSION 92
3.6 MESSUNG DER IL-8-PRODUKTION
NACH MODULATION DER NF-E2-EXPRESSION
IN CD34
+
-ZELLEN 93
3.7 MESSUNG VON IL-8
NACH MODULATION DER NF-E2-EXPRESSION IN U937 94
3.7.1 INFEKTION VON U937-ZELLEN MIT DEN LENTIVIRALEN KONSTUKTEN ZUR
MODULATION VON NF-E2 95
3.7.2 NF-E2 UEBEREXPRESSION
FUEHRT ZU GESTEIGERTER IL-8-PRODUKTION 96
3.8 MESSUNG DER IL-8-PRODUKTION IN
ZELLLINIEN NACH KNOCKDOWN VON NF-E2 98
3.8.1 INFEKTION VON UKE1, SET-2 UND HEL MIT DEN LENTIVIRALEN KONSTUKTEN
ZUR
HERABREGULATION VON NF-E2 98
3.8.2 NF-E2 HERABREGULATION FUEHRT ZU VERMINDERTER IL-8-PRODUKTION 100
3.9 ANALYSE DER NF-E2-ABHAENGIGEN AKTIVITAET DES IL-8-PROMOTERS 101
3.9.1 ERSTELLUNG EINES IL-8-PROMOTER-REPORTER-KONSTRUKTS 102
3.9.2 MESSUNG DER NF-E2-ABHAENGIGEN AKTIVITAET DES
IL-8-PROMOTER-REPORTER-KONSTRUKTS 104
3.9.3 MUTATION DER POTENTIELLEN BINDESTELLEN VON NF-E2 IM
IL-8-PROMOTER-REPORTER-KONSTRUKT 105
3.9.4 MESSUNG DER NF-E2-ABHAENGIGEN AKTIVITAET IM
IL-8-PROMOTER-REPORTER-KONSTRUKT
NACH MUTATION DER POTENTIELLEN BINDESTELLEN 107
4 DISKUSSION 109
4.1 DIE LRSC EIGNET SICH ALS QUELLE
ZUR PRAEPARATION VON CD34
+
-ZELLEN 110
4.2 ETABLIERUNG EINES LENTIVIRALEN VEKTORSYSTEMS ZUR MODULATION VON
NF-E2 111
4.3 MODULATION DER NF-E2-EXPRESSION IN
HAEMATOPOETISCHEN, CD34
+
STAMMZELLEN
UND DEREN GENOMWEITE AUSWIRKUNGEN
IN DER EXON-ARRAY-ANALYSE 113
4.4 MODULATION VON NF-E2
FUEHRT ZUR REGULATION VON
IL-8 IN CD34
+
-ZELLEN 118
4.5 UEBEREXPRESSION VON NF-E2 STEIGERT DIE IL-8 PRODUKTION
IN U937-ZELLEN 118
4.6 HERABREGUALTION VON NF-E2
IN MPN-ZELLLINIEN SENKT DIE PRODUKTION VON
IL-8 119
4.7 NF-E2 REGULIERT IL-8
DURCH DIREKTE INTERAKTION AM
IL-8-PROMOTER 120
4.8 AUSBLICK 122
5 ZUSAMMENFASSUNG 123
6 LITERATURVERZEICHNIS 124
7 DANKSAGUNG 139
8 LEBENSLAUF 140
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