Rekrudeszenz der Spermatogenese beim Hund nach gezielter Aufhebung der Downregulation der germinativen und endokrinen Hodenfunktion: Untersuchungen unter besonderer Berücksichtigung des Androgenrezeptors:
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Gießen, Lahn
VVB Laufersweiler Verlag
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Tabellenverzeichnis XVIII
Abbildungsverzeichnis XXI
Abkürzungsverzeichnis XXV
1 Einleitung 1
2 Literaturübersicht 3
2 1 Anatomie und Histologie des adulten Hodens 3
211 Lage und Morphologie des Hodens 3
212 Histologie des Hodens 4
2121 Intertubuläre Zellen des Hodens 4
21211 Leydigzellen 4
21212 Leydig-like Cells 5
21213 Myoidzellen 6
2122 Intratubuläre Zellen des Hodens 6
21221 Sertolizellen 7
21222 Gonozyten 8
21223 Spermatogonien 8
21224 Spermatozyten 9
21225 Spermatiden 11
2 2 Erscheinungsbild des postnatalen (juvenilen) Hodens 12
221 Descensus testis 12
222 Histologisches Erscheinungsbild 13
IX
Inhaltsverzeichnis
223 Steroidogenese 14
2 3 Ablauf der Spermatogenese 14
231 Stadien der Spermatogenese 14
2311 Spermatogoniogenese 15
2312 Spermatozytogenese 15
2313 Spermiogenese 15
232 Spermatogenesezyklus 15
233 Keimepithelzyklus 16
234 Staging der Spermatogenese des Hundes 16
2 4 Neuroendokrine Regulation der Hodenfunktion 19
241 Gonadotropin Releasing Hormone 19
242 Gonadotropine 20
2421 Luteinisierendes Hormon 20
2422 Follikelstimulierendes Hormon 21
2 5 Testikuläre Hormonsynthese bei spezieller Berücksichtigung d Situation b
Rüden 22
251 Steroidhormone 22
2511 Testosteron 22
2512 Östrogene 24
252 Sonstige hormonelle Wirkstoffe testikulären Ursprungs 26
2521 Inhibin und Aktivin 26
2522 Relaxin 28
2523 Relaxin-like Faktor (RLF)/Insulin-like Peptide 3 (INSL3) 29
2524 Oxytocin 30
2525 Prostaglandine 30
2526 GnRH-like Faktor 31
2527 Ghrelin 32
2 6 Wirkung des Steroidhormons Testosteron 33
261 Genomische Wirkung 33
2611 Androgenrezeptor 33
2612 Abruf der genomischen Wirkung 34
X
Inhaltsverzeichnis
262 Nicht-genomische Wirkung 35
2 7 Proliferation und Apoptose des Hodens 35
271 Proliferation 35
2711 Ki-67 36
272 Apoptose 37
2721 Apoptose im Rahmen der Spermatogenese 37
2722 Apoptotische Signaltransduktion 38
27221 Caspase-3 40
3 Material und Methode 42
3 1 Versuchstiere 42
311 Tierversuchsantrag 45
312 Versuchstierhaltung 45
3 2 Versuchsziel und -aufbau 45
321 Untersuchungsprotokolle und Probennahme 49
3211 Aufnahmeuntersuchung 49
3212 Blutprobennahme 50
3213 Implantation eines GnRH-Analogons 51
32131 „Gonazon®“ 18,5 mg-Implantat für Hunde 51
32132 „Profact® Depot“ 51
3214 Explantation des GnRH-Analogons „Gonazon®“ 51
3215 Kontrolluntersuchungen 52
3216 Orchidektomie 52
3 3 Aufarbeitung der Hoden 52
331 Probenaufarbeitung für die histologischen und immunhistochemi-
schen Untersuchungen 53
3311 Fixierung 53
33111 Bouin sehe Lösung 53
33112 Formol nach Lillie 53
3312 Einbettung 53
3313 Schnittpräparation 54
XI
Inhaltsverzeichnis
332 Probenaufarbeitung für die rnolekularbiologischen Untersuchungen 54
3321 Probenkonservierung 54
3322 Extraktion von Gesamtprotein und RNA 54
33221 Gesamtprotein 55
33222 RNA-Extraktion 55
3323 Photometrische Konzentrationsbestimmung 56
33231 Gesamtprotein 56
33232 RNA 56
3324 Herstellung einer Arbeitsverdünnung 57
33241 Gesamtprotein 57
33242 RNA 57
3 4 Histologische Untersuchung 57
341 Hämatoxylin-Eosin-Färbung 57
3411 Auswertung 58
3 5 Western Blot 60
351 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 61
352 Western Blot 64
353 Ponceau-S-Färbung 64
354 Immundetektion des Androgenrezeptors 65
3 6 Immunhistochemische Untersuchungen 66
361 Einfachfärbung 67
3611 Androgenrezeptor (AR) 67
36111 Immunhistochemische Darstellung 67
36112 Auswertung 70
3612 Proliferationsmarker Ki-67 73
36121 Immunhistochemische Darstellung 73
36122 Auswertung 74
3613 Apoptosemarker Caspase-3 aktiviert 74
36131 Immunhistochemische Darstellung 74
36132 Auswertung 76
362 Doppelfärbung 76
XII
Inhaltsverzeichnis
3621 Androgenrezeptor / Vimentin 76
36211 Auswertung 78
3 7 TUNEL 78
371 ApopTag® Peroxidase Kit 79
3711 Auswertung 81
3 8 Molekularbiologische Untersuchungen 81
381 Reverse Transkriptase - Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) 81
3811 DNase-Behandlung 81
3812 Reverse Transkription 82
3813 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 84
382 Isolierung der PCR-Produkte 87
3821 Agarose-Gelelektrophorese 87
3822 Gel-Extraktion 89
383 Reverse Transkriptase - quantitative real-time Polymerase-Ketten-
reaktion (RT-qPCR) 90
3831 Quantitative real-time PCR (qPCR) mit TaqMan®-Hydro-
lyse-Sonden 91
38311 Auswertung 94
3 9 Hormonanalyse 97
391 Testosteron 97
392 LH 97
393 FSH 98
3 10 Statistische Auswertung 98
3 10 1 Hornionanalytische Daten 99
3 10 2 Sonstige analytische Parameter 99
3 10 2 1 Datenanalyse I (DatAI) 99
3 10 2 2 Datenanalyse II (DatAII) 100
3 10 3 Signifikanzniveau 100
3 11 Fixierungen, Puffer und Lösungen 101
3 11 1 Allgemein 101
3 11 2 Probengewinnung und -konservierung 102
XIII
Inhaltsverzeichnis
3 11 3 Histologie und Immunhistochemie 102
3 11 4 TUNEL 105
3 11 5 Proteinextraktion und Western Blot 106
3 11 6 RNA-Extraktion und PCR 109
3 12 Reagentien und Chemikalien (Hersteller/Lieferant) 111
3 13 Verbrauchsmaterialien (Hersteller/Lieferant) 116
3 14 Angewandte Gerätschaften (Hersteller/Lieferant) 118
3 15 Programme und Software 122
4 Ergebnisse 123
4 1 Tubuli seminiferi contorti 123
411 Zuordnung nach dem Stand der Spermatogenese 123
4111 Versuchsgruppe „Gonazon®“ 123
41111 Gruppen DG A, DG B und DG C 124
41112 Gruppe DG D 127
4112 Versuchsgruppe „Kontrolle adult“ 130
4113 Versuchsgruppe „Profact®“ 131
4114 Versuchsgruppe „juvenil“ 133
412 Flächeninhalt des Tubulusquerschnittes 135
4121 Versuchsgruppe „Gonazon®“ 135
4122 Versuchsgruppen DG A, „Profact®“ und „juvenil“ 136
4 2 Androgenrezeptor 138
421 Western Blot 138
422 Immunhistochemische Untersuchung 139
4221 Identifizierung Androgenrezeptor (AR)-positiver tubulä-
rer Zellen 139
4222 Quantitativer Nachweis der Expression des Androgenre-
zeptors (AR) im Gesamthoden 142
42221 Definition der erfassten AR-positiven Zellen 142
42222 Expression des AR in den Sertolizellen (SZ) 142
422221 Versuchsgruppe „Gonazon®“ 144
XIV
Inhaltsverzeichnis
422222 Versuchsgruppen DG A, „Profact®“ und „ju-
venil“ 146
42223 Expression des AR in den Spermatogonien 148
422231 Versuchsgruppe „Gonazon®“ 149
422232 Versuchsgruppen DG A, „Profact®“ und „ju-
venil“ 149
42224 Expression des AR in den Leydigzellen 151
422241 Versuchsgruppe „Gonazon®“ 151
422242 Versuchsgruppen DG A, „Profact®“ und „ju-
venil“ 155
42225 Expression des Androgenrezeptors (AR) in Ab-
hängigkeit vom Tubulustyp 158
423 Expression des Androgenrezeptors (AR) auf mRNA-Ebene 160
4231 RT-PCR 160
42311 Sequenzierung 160
4232 RT-qPCR 161
42321 Versuchsgruppe „Gonazon®“ 162
42322 Versuchsgruppen DG A, „Profact®“ und „juvenil“ 162
4 3 Ki-67 164
431 Immunhistochemische Untersuchung 164
4311 Qualitativer Nachweis der Expression des Ki-67 in Kon-
trollgewebe 164
4312 Definition der erfassten Ki-67-positiven Zellen 164
4313 Expression des Ki-67 in den Spermatogonien 166
43131 Versuchsgruppe „Gonazon®“ 166
43132 Versuchsgruppen DG A, „Profact®“ und „juvenil“ 169
4314 Expression des Ki-67 in Abhängigkeit des Tubulustyps 170
4 4 Caspase-3 172
441 Expression der Caspase-3 auf Proteinebene 172
4411 Histochemischer Methodenvergleich 172
442 Immunhistochemie aktivierte Caspase-3 174
XV
Inhaltsverzeichnis
4421 Expression der aktivierten Caspase-3 175
44211 Versuchsgruppe „Gonazon®“ 176
44212 Versuchsgruppen DG A, „Profact®“ und „juvenil“ 176
443 Expression der Caspase-3 auf mRNA-Ebene 176
4431 RT-PCR 176
44311 Sequenzierung 177
4432 RT-qPCR 177
44321 Versuchsgruppe „Gonazon®“ 178
44322 Versuchsgruppe DG A „Profact®“ und „juvenil“ 179
4 5 Hormone 181
451 Testosteron 181
4511 Versuchsgruppe „Gonazon®“ 181
4512 Versuchsgruppe „Profact®“ 186
452 LH und FSH 186
4521 Versuchsgruppe „Gonazon®“ 186
4522 Versuchsgruppe „Profact®“ 186
5 Diskussion 188
5 1 Versuchsaufbau 188
5 2 Probengewinnung und -konservierung 190
521 Blutproben 190
522 Gewebeproben 190
5 3 Methodik 191
531 Hormonanalyse 191
532 Histologie 192
533 Western Blot 193
534 Immunhistochemie 194
5341 Immunhistochemische Einfachfärbung 194
5342 Immunhistochemische Doppelfärbung 195
535 TUNEL 196
536 RT-PCR und RT-qPCR 197
XVI
Inhaltsverzeichnis
5 4 Ergebnisse 198
541 GnRH-Analogon „Gonazon®“ 198
5411 Erreichung einer hormonellen Downregulation 198
5412 Testikuläre Rekrudeszenz 199
542 GnRH-Analogon „Profact® Depot“ 211
543 Juveniler Hoden 212
6 Zusammenfassung 215
7 Summary 220
Literaturverzeichnis 224
Danksagung 271
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| spelling | Spang, Astrid Verfasser (DE-588)1082208337 aut Rekrudeszenz der Spermatogenese beim Hund nach gezielter Aufhebung der Downregulation der germinativen und endokrinen Hodenfunktion: Untersuchungen unter besonderer Berücksichtigung des Androgenrezeptors eingereicht von Astrid Spang, Neuwied Gießen, Lahn VVB Laufersweiler Verlag 2016 XXXI, 273 Seiten Illustrationen txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Edition Scientifique Dissertation Justus-Liebig-Universität Gießen 2016 cabi spermatogenesis cabi hormone secretion cabi regulation cabi dog Doktorarbeit Uni Wissenschaft (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content VVB LAUFERSWEILER Verlag (DE-588)1065553803 pbl HEBIS Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=030352472&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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