Interzelluläre kommunikation durch endotheliale mikrovesikel micrornas in Vitro und in Vivo:
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| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
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Gießen, Lahn
VVB Laufersweiler Verlag
2015
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| Series: | Edition Scientifique
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ABKUERZUNGSVERZEICHNIS................................................................................................
5
INHALTSVERZEICHNIS..........................................................................................................11
1
EINLEITUNG.................................................................................................................18
1.1 DAS KARDIOVASKULAERE SYSTEM
............................................................................
18
1.1.1
FUNKTIONEN...................................................................................................
18
1.1.2 AUFBAU DES BLUTKREISLAUFS UND DES
HERZENS............................................... 18
1.1.3 AUFBAU DER BLUTGEFAESSE
................................................................................
20
1.1.4 STROEMUNGSVERHAELTNISSE UND SCHUBSPANNUNG
.............................................
22
1.2 ERKRANKUNGEN DES KARDIOVASKULAEREN
SYSTEMS..............................................24
1.2.1
ATHEROSKLEROSE.............................................................................................25
1.2.1.1 AETIOLOGIE DER ATHEROSKLEROSE
................................................................
25
1.2.1.2 PATHOGENESE DER ATHEROSKLEROSE
...........................................................
25
1.2.1.3 ROLLE DER IMMUNZELLEN UND DER MILZ IN DER ATHEROGENESE
................
29
1.2.1.4 FOLGEN DER
ATHEROSKLEROSE.....................................................................30
1.2.2 AKUTER
MYOKARDINFARKT................................................................................
31
1.3 NICHT-KODIERENDE RN AS
...................................................................................
32
1.4
MICRORNAS........................................................................................................34
1.4.1 FUNKTIONEN VON MIRNAS
.............................................................................
35
1.4.2 MICRORNAS IM KARDIOVASKULAEREN
BEREICH..................................................37
1.5 INTERZELLULAERE
KOMMUNIKATION.......................................................................
40
1.5.1 EXTRAZELLULAERE MICRORNAS IN INTERZELLULAERER KOMMUNIKATION
.................
40
1.5.2 EXTRAZELLULAERE
VESIKEL.................................................................................
43
1.5.2.1 APOPTOTISCHE KOERPERCHEN
.43
1.5.2.2 MIKROVESIKEL
A4
1.5.2.3
EXOSOMEN.............................................................................................
44
1.5.2.4 AUFNAHME UND INTERAKTION DER EXTRAZELLULAEREN VESIKEL MIT
EMPFAENGERZELLEN...................................................................................45
1.6 ZIEL DER
ARBEIT.....................................................................................................47
MATERIAL UND
METHODEN........................................................................................49
2.1
MATERIAL..............................................................................................................
49
2.1.1
VERBRAUCHSMATERIAL.....................................................................................49
2.1.2 TECHNISCHE GERAETE
......................................................................................
50
2.1.3
KITS..............................................................................................................
51
2.1.4 REAGENZIEN UND
CHEMIKALIEN.....................................................................52
2.1.5
ZYTOKINE......................................................................................................
53
2.1.6
PRIMER.........................................................................................................
54
2.1.6.1 PRIMER FUER SYBR GREEN
QRT-PCR.......................................................54
2.1.6.2
TAQMANASSAYS......................................................................................54
2.1.7 ANTIKOERPER
FACS........................................................................................
55
2.1.8 ZELLKULTUR - PRIMAERE ZELLEN,
ZELLLINIEN....................................................... 57
2.1.9
ZELLKULTUR-MEDIEN......................................................................................57
2.1.10
TIERE............................................................................................................
58
2.1.10.1
FUTTER.....................................................................................................
58
2.1.10.2 VERWENDETE MAEUSE (MUS MUSCULUS)
....................................................
58
2.1.10.3
MEDIKAMENTE........................................................................................59
2.1.11
SOFTWARE......................................................................................................
60
2.2
METHODEN............................................................................................................
61
2.2.1 ZELLKULTUR
61
2.2.1.1 ISOLATION VON CD 14+ MONOZYTEN AUS MENSCHLICHEM
PERIPHEREN
BLUT......................................................................................61
2.2.1.2 DIFFERENZIERUNG VON CD 14+ MONOZYTEN ZU MAKROPHAGEN
................
61
2.2.1.3 KULTIVIERUNG DER
ZELLEN.........................................................................62
2.2.1.4 PASSAGE UND AUSBRINGUNG DER ZELLEN
...................................................
63
2.2.1.5 TRANSDUKTION DER ZELLEN (HUVEC, MECHSV)
....................................
64
2.2.1.6 TRANSAKTION DER ZELLEN (HUVEC, MECHSV) MIT
REKOMBINANTER CEL-MIR-39 BZW. PRE-MIR-92A
....................................
64
2.2.2 EXTRAZELLULAERE VESIKEL
.................................................................................
66
2.2.2.1 GENERIERUNG VON EXTRAZELLULAEREN VESIKELN (EV) DURCH
HUVECS UND
MECHSVS.....................................................................
66
2.2.2.2 ISOLATION VON MIKROVESIKELN AUS UEBERSTAENDEN VON HUVECS
UND
MECHSVS.......................................................................................66
2.2.2.3 TRANSFER VON MIKROVESIKELN ZU
EMPFAENGERZELLEN................................67
2.2.2.4 AUFARBEITUNG DER ISOLIERTEN MIKROVESIKEL FUER DIE INJEKTION IN
DIE M
AUS................................................................................................67
2.2.2.5 AUFARBEITUNG DER ISOLIERTEN MIKROVESIKEL FUER RNA-ANALYSE
..............
67
2.2.3 DURCHFLUSSZYTOMETRIE DER
ZELLEN................................................................
67
2.2.4 MOLEKULARE BIOLOGIE
...................................................................................
70
2.2.4.1 RNA-ISOLATION MIT QIAZOL UND MIRNEASY MINI K
IT........................70
2.2.4.2 RNA-ISOLATION MIT QIAZOL, MIRNEASY MINI KIT UND DEM
QIACUBE.................................................................................................70
2.2.4.3 RNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
........................................................
70
2.2.4.4 REVERSE TRANSKRIPTION VON MRNA
.......................................................
71
2.2.4.5 QUANTITATIVE REAL-TIME PCR (QRT-PCR) VON
MRNA...........................71
2.2.4.6 REVERSE TRANSKRIPTION VON MIRNA
2.2.4.7 QRT-PCR VON
MIRNAS.......................................................................74
2.2.5
TIERVERSUCHE..............................................................................................
75
2.2.5.1 HALTEBEDINGUNGEN DER
TIERE................................................................75
2.2.5.2 INTRAVENOESE INJEKTION DER MIKROVESIKEL IN DIE SCHWANZVENE
( VENA
CAUDALIS)....................................................................................
76
2.2.5.3 MODELL DES AKUTEN
MYOKARDINFARKTS....................................................76
2.2.5.4 ATHEROSKLEROSE-MODELL IN APOE/_ MAEUSEN
........................................
78
2.2.5.5 ORGANENTNAHME UND AUFARBEITUNG FUER RNA-ISOLATION
.......................
78
2.2.5.6 GEWINNUNG VON MONONUKLEAEREN ZELLEN AUS DER MILZ UEBER
DICHTEGRADIENTEN..................................................................................
79
22.5.1 GEWINNUNG VON MAKROPHAGEN AUS DER BAUCHHOEHLE
...........................
79
2.2.5.8 AKTIVIERUNG DER DIFFERENZIERUNG VON PERITONEAL-MAKROPHAGEN
ZU ML - ODER
M2-MAKROPHAGEN...........................................................80
2.2.6
HISTOLOGIE...................................................................................................
81
2.2.6.1 PARAFFINEINBETTUNG UND
GEWEBESCHNITTE..............................................81
2.2.6.2 KOLLAGENFAERBUNG MIT
PIKRO-SIRIUSROT................................................... 81
2.2.6.3
HAEMATOXYLIN-EOSIN-FAERBUNG...............................................................
82
2.2.7
STATISTIK.......................................................................................................82
ERGEBNISSE..............................................................................................................83
3.1 CHARAKTERISIERUNG UND QUANTIFIZIERUNG DES TRANSFERS VON MIT
MICRORNAS BELADENEN MIKROVESIKELN IN UNTERSCHIEDLICHE
EMPFAENGERZELLEN................................................................................................83
3.1.1 MIKROVESIKEL VON MOCK/KLF2-TRANSDUZIERTEN HUVECS
TRANSFERIEREN CEI-MIR-39 IN VITRO IN UNTERSCHIEDLICHEM MASSE ZU
EMPFANGERZELLEN DES KARDIOVASKULAEREN SYSTEMS
.......................................
83
3.1.2 MIKROVESIKEL VON MOCK/KLF2-TRANSDUZIERTEN MURINEN
ENDOTHELZELLEN TRANSFERIEREN DIE EXOGENE MICRORNA CEL-MIR-39
IN VITRO IN MONONUKLEAERE ZELLEN DER MILZ VON C57BL/6J MAEUSEN
..........
91
3.2 TRANSFER DER MIT CEL-MIR-39 BELADENEN MIKROVESIKEL VON MURINEN
ENDOTHELZELLEN IN UNTERSCHIEDLICHE GEWEBE VON
KONTROLLMAEUSEN..................92
3.2.1 MIKROVESIKEL VON KLF2-TRANSDUZIERTEN MURINEN ENDOTHELZELLEN
SIND NACH INTRAVENOESER INJEKTION IN VIVO NICHT IN DER LAGE,
CEL-MIR-39 IN NICHT AKTIVIERTES GEWEBE ZU
TRANSFERIEREN..........................94
3.2.2 DIE MILZ VON GESUNDEN C57BL/6J MAEUSEN ZEIGT NACH
INTRAVENOESER INJEKTION DER MIKROVESIKEL VON MURINEN
ENDOTHELZELLEN LEDIGLICH EINEN MINIMALEN ANSTIEG AN CEL-MIR-39
...........
97
3.3 TRANSFER VON CEL-MIR-39-BELADENEN, ENDOTHELIALEN MIKROVESIKELN IN
ZWEI UNTERSCHIEDLICHEN KRANKHEITSMODELLEN
...................................................
99
3.3.1 TRANSFER IM MURINEN
MYOKARDINFARKT-MODELL............................................99
3.3.1.1 MIKROVESIKEL VON KLF2-TRANSDUZIERTEN MURINEN
ENDOTHELZELLEN TRANSFERIEREN CEL-MIR-39 IN VIVO NUR
GERINGFUEGIG IN DURCH AKUTEN MYOKARDINFARKT AKTIVIERTES
GEWEBE................................................................................................
100
3.3.1.2 MIKROVESIKEL VON KLF2-TRANSDUZIERTEN MURINEN
ENDOTHELZELLEN SIND IN VIVO NICHT IN DER LAGE, DIE ENDOGENE
MIR-92A IN DURCH AKUTEN MYOKARDINFARKT AKTIVIERTES GEWEBE
VON MIR-92AV MAEUSEN ZU
TRANSFERIEREN.............................................103
3.3.2 TRANSFER IM MURINEN
ATHEROSKLEROSE-MODELL...........................................105
3.3.2.1 MIKROVESIKEL VON MURINEN ENDOTHELZELLEN TRANSPORTIEREN DIE
EXOGENE CEL-MIR-39 IN VIVO IN DIE DURCH ATHEROSKLEROSE
AKTIVIERTE
MILZ......................................................................................105
3.3.3 BIOLOGISCHE FUNKTION DER MIKROVESIKEL IM MURINEN
ATHEROSKLEROSE-MODELL..............................................................................109
3.3.3.1 MIKROVESIKEL VON KLF2-TRANSDUZIERTEN MURINEN
ENDOTHELZELLEN REDUZIEREN TENDENZIELL IN VIVO DEN ANTEIL AN
M 1-MAKROPHAGEN IN DER MILZ VON APOE
MAEUSEN..........................109
3.4 INKUBATION VON MAKROPHAGEN MIT MIKROVESIKELN VON
MOCK/KLF2-TRANSDUZIERTEN ENDOTHELZELLEN FUEHRT IN VITRO ZU EINER
ERHOEHUNG DER M 1 -MARKER UND DER ZELLZAHL
....................................................
118
4
DISKUSSION.............................................................................................................125
4.1 MIKROVESIKEL VON TRANSDUZIERTEN & TRANSFERIERTEN ENDOTHELZELLEN
TRANSPORTIEREN MIR IN ZELLEN DES KARDIOVASKULAEREN SYSTEMS
..........................
125
4.2 MIKROVESIKEL VON TRANSDUZIERTEN & TRANSFERIERTEN ENDOTHELZELLEN
TRANSFERIEREN MIR IN
SPLENOZYTEN.....................................................................
130
4.3 MIKROVESIKEL VON TRANSDUZIERTEN & TRANSFRIERTEN ENDOTHELZELLEN
TRANSFERIEREN MIR IN VIVO LEDIGLICH IN DIE
LEBER..............................................130
4.4 TRANSFER VON ENDOTHELIALEN MIKROVESIKELN IM AKUTEN
MYOKARDINFARKT-MODELL...................................................................................
132
4.4.1 GERINGER TRANSPORT VON MIR AUS TRANSDUZIERTEN & TRANSFERIERTEN
ENDOTHELZELLEN IN ZIELGEWEBE TROTZ AKTIVIERUNG DURCH
MYOKARDINFARKT.........................................................................................
132
4.5 TRANSFER VON ENDOTHELIALEN MIKROVESIKELN IM ATHEROSKLEROSE-MODELL
..........
135
4.5.1 MIKROVESIKEL VON TRANSDUZIERTEN & TRANSFERIERTEN ENDOTHELZELLEN
TRANSPORTIEREN MIR IN VIVO IN DIE DURCH ATHEROSKLEROSE AKTIVIERTE
MILZ...........................................................................................................
135
4.5.2 MIKROVESIKEL VON KLF2-TRANSDUZIERTEN ENDOTHELZELLEN REDUZIEREN
IN VIVO DEN ANTEIL AN M 1-MAKROPHAGEN IN DER MILZ LEICHT
.....................
137
4.6 INKUBATION VON MAKROPHAGEN MIT MIKROVESIKELN VON TRANSDUZIERTEN
ENDOTHELZELLEN FUHRT IN VITRO ZU EINER ERHOEHUNG DER M 1 -MARKER UND
DER
ZEITZAHL.......................................................................................................
139
4.7 FAZIT UND
AUSBLICK...........................................................................................
141
5
ZUSAMMENFASSUNG...............................................................................................
145
6
SUMMARY...............................................................................................................
147
REFERENZEN....................................................................................................................
149
EIDESSTATTLICHE
ERKLAERUNG...........................................................................................
157
DANKSAGUNG..................................................................................................................
158
|
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| spelling | Maron, Anne Christine Verfasser (DE-588)1080873376 aut Interzelluläre kommunikation durch endotheliale mikrovesikel micrornas in Vitro und in Vivo eingereicht von Anne Christine Maron, Frankfurt a.M. Gießen, Lahn VVB Laufersweiler Verlag 2015 159 Seiten Illustrationen 21 cm x 14.6 cm, 219 g txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Edition Scientifique Dissertation Justus-Liebig-Universität 2015 endothelium cabt cellular biology cabt in vitro cabt Doktorarbeit Uni Wissenschaft (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content VVB LAUFERSWEILER Verlag (DE-588)1065553803 pbl DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=030307712&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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