Molekulare Charakterisierung von humanen Gedächtnis-B-Zellen spezifisch für Nukleoproteine (NP) von Influenza-A-Virus:
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Leipzig
[2017]
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1.
EINLEITUNG.........................................................................................................................
1
1.1. DAS IMMUNSYSTEM IM KAMPF GEGEN DIE VIMSINFEKTION
.............................................
1
1.2. ANTIKOERPER: AUFBAU UND
FUNKTION................................................................................2
1.2.1.
AUFBAU.................................................................................................................
2
1.2.2. FUNKTION (ANTIVIRALE AKTIVITAET DER
ANTIKOERPER)....................................................4
1.3. VIELFALT DES
ANTIKOERPERREPERTOIRES...............................................................................5
1.3.1. KOMBINATORISCHE V IELFALT
....................................................................................
6
1.3.2. .FUNKTIONALE VIELFALT
(VERKNUEPFUNGSVIELFALT).........................................................
7
1.3.3. SOMATISCHE
HYPERMUTATION..................................................................................7
1.4. EPITOP UND
PARATOP.......................................................................................................7
1.5.
B-ZELLEN......................................................................................................................
8
1.6. DAS IMMUNOLOGISCHE
GEDAECHTNIS.................................................................................9
1.7.
INFLUENZA....................................................................................................................10
1.7.1. DAS
INFLUENZA-A-VIRUS.......................................................................................10
1.7.2. IMMUNANTWORT GEGEN DAS NUKLEOPROTEIN
............................................................
11
1.7.3. FUNKTION DES
NUKLEOPROTEINS..............................................................................
12
2.
MATERIAL..........................................................................................................................
14
2.1.
REAGENZIEN.................................................................................................................14
2.2.
RESTRIKTIONSENZYME...................................................................................................16
2.3.
PLASMIDE.....................................................................................................................17
2.4. MEDIEN, PUFFER,
LOESUNGEN.........................................................................................
17
2.5. T ECHNISCHE AUSSTATTUNG
............................................................................................
21
2.6.
VERBRAUCHSMATERIAL....................................................................................................23
2.7.
SOFTWARE....................................................................................................................
25
2.8. COMMERCIAL
KITS.......................................................................................................
25
2.9.
ANTIKOERPER.................................................................................................................
25
2.10.
PRIMER.......................................................................................................................
26
METHODEN.........................................................................................................................
28
3.1. MAGNETISCHE ANREICHERUNG VON ANTIGEN-SPEZIFISCHEN
GEDAECHTNIS-B-ZELLEN
............
28
3.1.1. DIE
ANTIGENE.....................................................................................................
28
3.1.2.
PROBANDEN..........................................................................................................
29
3.1.3. KOPPLUNG VON ANTIGENEN AN MAGNETISCHE BEADS
................................................
29
3.1.4. ISOLIERUNG VON MONONUKLEAEREN ZELLEN DES PERIPHEREN BLUTES (PBMCS)
DURCH
DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION
.......................................................................................
30
3.1.5. ANREICHERUNG VON B-ZELLEN
...............................................................................
30
3.1.6. DEPLETION DER NAIVEN B-ZELLEN (IGM+
B-ZELLEN)....;...........................................31
3.1.7. ANREICHERUNG DER ANTIGEN-SPEZIFISCHEN GEDAECHTNIS-B-ZELLEN
..........................
32
3.2. SPEZIFITAETS- UND REINHEITSKONTROLLE DER ANTIGEN-SPEZIFISCHEN
GEDAECHTNIS-B-ZELLEN 33
3.2.1. POLYKLONALE AKTIVIERUNG DER ANTIGEN-SPEZIFISCHEN
GEDAECHTNIS-B-ZELLEN
.........
34
3.2.2. ELISPOT ALS SPEZIFITAETSKONTROLLE FUER ANTIGEN-SPEZIFISCHE
GEDAECHTNIS-B-ZELLEN 35
3.2.3. REINHEITSKONTROLLE FUER ANTIGEN-SPEZIFISCHE GEDAECHTNIS-B-ZELLEN
.....................
37
3.3. AMPLIFIZIERUNG UND KLONIERUNG DER VARIABLEN
DOMAENE............................................37
3.3.1. VEREINZELUNG DER
ZELLEN....................................................................................37
3.3.2. DIE REVERSE TRANSKRIPTASE-POLYMERASE-KETTENREAKTION (RT-PCR)
....................
38
3.3.3.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE................................................................................41
3.3.4. EXPRESSIONSPLASMIDE
.........................................................................................
41
3.3.5. KONSTRUKTION DER
EXPRESSIONSPLASMIDE..............................................................42
3.3.6. AUFFEINIGUNG DER DNA
......................................................................................
44
3.3.7. RESTRIKTIONSVERDAU DER AMPLIFIZIERTEN VARIABLEN
REGION....................................44
3.3.8. EIGATION UND TRANSFORMATION
............................................................................
45
3.3.9. HERSTELLUNG DER KOMPETENTEN E.COLI-TOP
10-BAKTERIEN.....................................46
3.3.10. TRANSFORMATION DER EXPRESSIONSPLASMIDE IN KOMPETENTE E.COLI-TOP
10
...........
46
3.3.11. MINI-PRAEPARATION DER
EXPRESSIONSPLASMIDE.......................................................47
3.3.12. VERDAU DER EXPRESSIONSPLASMIDE MIT
RESTRIKTIONSENZYMEN..............................47
3.3.13. SEQUENZIERUNG DER MONIERTEN VARIABLEN
DOMAENE..............................................48
3.4.
SEQUENZANALYSE.........................................................................................................
49
3.5. HERSTELLUNG VON REKOMBINANTEN ANTIGEN-SPEZIFISCHEN ANTIKOERPERN
.........................
49
3.5.1. TRANSIENTE TRANSAKTION IN
293T-ZELLEN............................................................49
3.5.2. SPEZIFITAETSTEST DER HERGESTELLTEN ANTIGEN-SPEZIFISCHEN ANTIKOERPER
....................
50
4.
ERGEBNISSE.......................................................................................................................
53
4.1. EXPERIMENTELLER
VERLAUF.............................................................................................53
4.2. ETABLIERUNG EINER METHODE ZUR ANREICHERUNG UND ZUM NACHWEIS
ANTIGEN
SPEZIFISCHER GEDAECHTNIS-B-ZELLEN
.......................................................................................
55
4.3. ANREICHERUNG UND AKTIVIERUNG DER NP-SPEZIFISCHEN
GEDAECHTNIS-B-ZELLEN
..............
57
4.4. ELISPOT ALS AG-SPEZIFITAETS- UND
REINHEITSKONTROLLE.................................................58
4.5.
KLONIERUNG DER
V
H
BZW. V
L
DER NP-SPEZIFISCHEN ANTIKOERPER
...................................
60
4.5.1. AMPLIFIZIERUNG DER
V
H
BZW.
V
L
DER NP-SPEZIFISCHEN ANTIKOERPER
......................
60
4.5.2.
RESTRIKTIONSVERDAU..............................................................................................61
4.6. GENETISCHE CHARAKTERISIERUNG DER VARIABLEN REGIONEN DER
NP-SPEZIFISCHEN
GEDAECHTNIS-B-ZELLEN...........................................................................................................
62
4.6.1. AMPLIFIZIERUNGSEFFIZIENZ UND
SINGLETONS...........................................................62
4.6.2. HAEUFIGKEIT DER V(D)J-FAMILIEN IN DEN NP-SPEZIFISCHEN SEQUENZEN
..................
63
4.6.3. ANZAHL DER IDENTIFIZIERTEN V(D)J-GEN-SEGMENTE IN DEN
NP-SPEZIFISCHEN
SEQUENZEN........................................................................................................................
66
4.6.4. INTER-INDIVIDUELLE VIELFALT DER V-GEN-SEGMENTE IN DEN
NP-SPEZIFISCHEN
SEQUENZEN........................................................................................................................
68
4.6.5. INTRA-INDIVIDUELLE VIELFALT DER V-GEN-SEGMENTE IN DEN
NP-SPEZIFISCHEN
SEQUENZEN.........................................................................................................................70
4.6.6.
MUTATIONSANALYSE................................................................................................72
4.6.7.
CDR3-LAENGE......................................................................................................73
4.6.8. INSERTIONEN UND
DELETIONEN................................................................................74
4.7. HERSTELLUNG UND DETEKTION DER REKOMBINANTEN NP-SPEZIFISCHEN
ANTIKOERPER
............
75
5.
DISKUSSION........................................................................................................................78
5.1. ANREICHERUNG DER HUMANEN AG-SPEZIFISCHEN GEDAECHTNIS-B-ZELLEN
..........................
79
5.2. AG-SPEZIFITAETS- UND REINHEITSKONTROLLE DER ANGEREICHERTEN
ZELLEN..........................80
5.3. KLONIERUNG DER VARIABLEN REGION DER NP-SPEZIFISCHEN
GEDAECHTNIS-B-ZELLEN
...........
82
5.4. MOLEKULARE CHARAKTERISIERUNG DER NP-SPEZIFISCHEN
GEDAECHTNIS-B-ZELLEN
...............
84
5.4.1. VIELFALT DER V(D)J-GEN-SEGMENTE DER NP-SPEZIFISCHEN
GEDAECHTNIS-B-ZELLEN.. 84
5.4.2. INTER-INDIVIDUELLE VIELFALT DER
V-GEN-SEGMENTE................................................86
5.4.3. INTRA-INDIVIDUELLE VIELFALT DER
V-GEN-SEGMENTE................................................86
5.4.4. MUTATIONEN UND
CDR3-REGION..........................................................................
87
5.4.5. INSERTIONEN UND
DELETIONEN................................................................................88
5.5. HERSTELLUNG UND ANALYSE DER NP-SPEZIFISCHEN
ANTIKOERPER........................................88
6.
ZUSAMMENFASSUNG...........................................................................................................
91
7.
REFERENZEN.......................................................................................................................
97
8.
ANHANG...........................................................................................................................107
8.1.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS...........................................................................................107
8.2.
PLASMIDKARTEN..........................................................................................................111
8.2.1. EXPRESSIONSPLASMID DER SCHWEREN
KETTE.......................................................... 111
8.2.2. EXPRESSIONSPLASMID DER LEICHTEN
KETTE............................................................. 112
8.3. LISTE DER NP-SPEZIFISCHEN
SEQUENZEN......................................................................113
8.3.1. SCHWERE
KETTE..................................................................................................113
8.3.2.
KAPPA-KETTE.....................................................................................................114
8.3.3.
LAMBDA-KETTE...................................................................................................116
8.4.
ABBILDUNGSVERZEICHNIS............................................................................................117
8.5. T
ABELLENVERZEICHNIS.................................................................................................118
9.
EIGENSTAENDIGKEITSERKLAERUNG............................................................................................119
10.
DANKSAGUNG.................................................................................................................120
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