Chlamydomonas reinhardtii als Expressionssystem für glykosylierte Proteine, am Beispiel der humanen β-Glucuronidase:
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| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
| Published: |
Erlangen ; Nürnberg
[2017]
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| adam_text | INHALT
INHALT..................................................................................................................................................I
ZUSAMMENFASSUNG........................................................................................................................
IX
ABSTRACT...........................................................................................................................................
X
A
EINLEITUNG...................................................................................................................................
1
1
GLYKANSTRUKTUREN.......................................................................................................................
1
1.1 AUFBAU UND BEDEUTUNG DER
W-GLYKOSYLIERUNG................................................................2
1.2 HUMANE
V-GLYKANE.........................................................................................................
4
2 PRODUKTIONSSYSTEME REKOMBINANTER GLYKOPROTEINE
..................................................................
4
3
MIKROALGEN................................................................................................................................
7
3.1 CHLAMYDOMONAS
REINHARDTII............................................................................................
8
3.2 CHLAMYDOMONAS REINHARDTII ALS PRODUKTIONSSYSTEM
.....................................................
9
3.3 V-GLYKOSYLIERUNG IN CHLAMYDOMONAS REINHARDTII
.....................................................
11
3.4 REGULATORISCHE ELEMENTE FUER DIE
GENEXPRESSION..........................................................
12
3.4.1
PROMOTOR...................................................................................................................
12
3.4.2
SELEKTIONSMARKER......................................................................................................
13
3.4.3
INTRON........................................................................................................................
13
3.4.4 UNTRANSLATED
REGION..................................................................................................
14
4 MODELLPROTEIN:
/?-GLUCURONIDASE.............................................................................................
14
4.1 HUMANE
/?-GLUCURONIDASE.............................................................................................
14
4.2 NACHWEIS DER
/?-GLUCURONIDASE....................................................................................
15
4.3 /?-GLUCURONIDASE IN CHLAMYDOMONAS
REINHARDTII.........................................................16
B
MOTIVATION................................................................................................................................
17
C MATERIAL UND
METHODEN..........................................................................................................
18
1
MATERIAL......................................................................................................................................18
1.1
CHEMIKALIEN.................................................................................................................
18
1.2
GERAETE...........................................................................................................................
19
1.3
VERBRAUCHSMATERIALIEN..................................................................................................
21
1.4
ORGANISMEN..................................................................................................................21
1.4.1
BAKTERIENSTAMM........................................................................................................
21
1.4.2
ALGENSTAEMME............................................................................................................
22
I
1.5
MEDIEN..........................................................................................................................
22
1.5.1
ALGENMEDIEN.............................................................................................................
22
1.5.2
BAKTERIENMEDIEN.......................................................................................................
23
1.6 KITS, ENZYME UND ANTIKOERPER
.......................................................................................
24
1.7
PLASMIDE.......................................................................................................................
25
1.8
PRIMER...........................................................................................................................
26
1.9
SOFTWARE........................................................................................................................27
METHODEN.................................................................................................................................
27
2.1 AUSGANGSPLASMID PCHLAMY_L
......................................................................................
27
2.2 ISOLIERUNG VON
GESAMT-RNA........................................................................................
28
2.2.1 RNA
EXTRAKTION........................................................................................................
28
2.2.2 DNASE
BEHANDLUNG...................................................................................................29
2.3
POLYMERASEKETTENREAKTION............................................................................................
29
2.3.1 REVERSE TRANSKRIPTASE GEKOPPELT MIT QUANTITATIVER
POLYMERASEKETTENREAKTION
......
29
2.3.1.1 REVERSE
TRANSKRIPTION............................................................................................
29
2.3.1.2 QUANTITATIVE POLYMERASEKETTENREAKTION
.................................................................
30
2.3.2
STANDARD-POLYMERASEKETTENREAKTION.........................................................................
31
2.3.2.1 GEN-AMPLIFIKATION FUER KLONIERUNGEN MIT DEM TANDEMPROMOTOR
HSP70A/RBCS2.31
2.3.2.2 GEN-AMPLIFIKATION FUER DIE INTEGRATION DESPSAD PROMOTOR UND D E R
.......................
Y UNTRANSLATED
REGION...........................................................................................
32
2.3.2.3 UEBERPRUEFUNG DER GENINTEGRATION IM
ALGENGENOM................................................ 33
2.4
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE..........................................................................................
34
2.5 HERSTELLUNG KOMPETENTER
ZELLEN...................................................................................
35
2.6
TRANSFORMATION.............................................................................................................
35
2.6.1 TRANSFORMATION VON ESCHERICHIA
COLI.......................................................................
35
2.6.2 TRANSFORMATION VON CHLAMYDOMONAS
REINHARDTII....................................................36
2.7 ISOLIERUNG UND AUFREINIGUNG VON
DNA........................................................................
37
2.7.1 AUFREINIGUNG VON
PCR-FRAGMENTEN..........................................................................
37
2.7.2
PLASMIDISOLIERUNG.....................................................................................................37
2.7.2.1 ALKALISCHE
LYSE....................................................................................................
37
2 .1 2 2 PLASMIDEXTRAKTION MIT DEM HIGH SPEED PLASMID MINI
KIT...................................38
2.7.3 ISOLIERUNG UND AUFREINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN
.................
38
2.7.4 ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA AUS CHLAMYDOMONAS REINHARDTII
.............................
38
2.8 BESTIMMUNG DER KONZENTRATION VON NUKLEINSAEUREN
...................................................
39
2.9 DNA SEQUENZIERUNG UND
SEQUENZANALYSE...................................................................39
2.10
KLONIERUNG....................................................................................................................39
2.10.1
RESTRIKTION................................................................................................................39
2.10.2
LIGATION....................................................................................................................40
2.11 CHARAKTERISIERUNG DES WACHSTUMS
...............................................................................
40
2.11.1 BESTIMMUNG DER OPTISCHEN
DICHTE............................................................................40
2.11.2 BESTIMMUNG DER
ZELLZAHL.........................................................................................41
2.11.3 BESTIMMUNG DER SPEZIFISCHEN WACHSTUMSRATE
........................................................
41
2.11.4 BESTIMMUNG DER BIOTROCKENMASSE
..........................................................................
42
2.12 KULTIVIERUNG VON CHLAMYDOMONAS REINHARDTII
...........................................................
42
2.12.1 KULTIVIERUNGSPARAMETER
1..........................................................................................42
2.12.2 KULTIVIERUNGSPARAMETER I I
........................................................................................42
2.12.3 KULTIVIERUNGSPARAMETER
III.......................................................................................42
2.12.4 KULTIVIERUNG IM ERLENMEYERKOLBEN
.........................................................................
42
2.12.4.1
DAUERKULTUREN.......................................................................................................42
2.12.4.2
VORKULTUREN...........................................................................................................43
2.12.4.3 KULTIVIERUNG IM ERLENMEYERKOLBEN ZUR PROTEINPRODUKTION
.................................
43
2.12.5 KULTIVIERUNG IM PHOTOBIOREAKTOR SCREENING MODUL
................................................
43
2.12.5.1 PHOTOBIOREAKTOR SCREENING MODUL
AUFBAU...........................................................43
2.12.5.2
VERSUCHSDURCHFUEHRUNG..........................................................................................44
2.12.5.3
VERSUCHSAUFBAU....................................................................................................45
2.12.5.4 INDUKTION DES TANDEMPROMOTORS HSP70A/RBCS2 DURCH HITZESCHOCK
...................
45
2.12.5.5
FUETTERUNGSVERSUCHE...............................................................................................46
2.12.6 KULTIVIERUNG IN DEM PHOTOBIOREAKTOR TYP MEDUSA
.................................................
46
III
2.12.6.1 MEDUSA
AUFBAU....................................................................................................
46
2.12.6.2
VERSUCHSDURCHFUEHRUNG..........................................................................................
47
2.13
PROTEINDETEKTION...........................................................................................................
47
2.13.1
SODIUMDODECYLSULFAT-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE...........................................47
2.13.2 WESTERN
BLOT.............................................................................................................
48
2.13.3 /?-GLUCURONIDASE
AKTIVITAETSTEST.................................................................................
49
2.13.3.1
DURCHFUEHRUNG........................................................................................................
49
2.13.3.2 MESSUNG IM MITHRAS MICROPLATE READER
...............................................................
50
2.13.3.3
AUSWERTUNG...........................................................................................................
50
2.13.3.4 SCREENING DER 268 TRANSFORMANTEN
.......................................................................
51
2.14
GLYKANANALYTIK............................................................................................................51
2.14.1 KOMPOSITIONSANALYSE DER ISOLIERTEN GLYKANE
............................................................
51
2.14.1.1 SAURE HYDROLYSE NACH
BLAKENEY...........................................................................
52
2.14.1.2 SAURE HYDROLYSE NACH GAMA
...............................................................................
52
2.14.1.3 SAURE HYDROLYSE
KOMBINIERT................................................................................
52
2.14.1.4
REDUKTION..............................................................................................................
52
2.14.1.5
ACETYLIERUNG........................................................................................................
53
2.14.1.6 MESSUNG MITTELS GASCHROMATOGRAPH-MASSENSPEKTROMETRIE
.................................
53
2.14.1.7 NACHWEIS- UND BESTIMMUNGSGRENZEN
...................................................................
54
2.14.1.8
WIEDERFINDUNGSRATEN............................................................................................
54
2.14.1.9
QUANTIFIZIERUNG.....................................................................................................
55
2.14.2 STRUKTURANALYSE DER V-GLYKANE MITTELS
EXOGLYCOSIDASE-VERDAU.............................55
2.14.2.1
PROBENVORBEREITUNG.............................................................................................
55
2.14.2.2
MESSMETHODE........................................................................................................
55
2.14.2.3
EXOGLYCOSIDASEVERDAU..........................................................................................
56
2.14.2.4 KALIBRIERGERADE DER DEXTRAN LEITER
.......................................................................
57
2.14.2.5 DATENBANK
GLYCOBASE..........................................................................................
57
D
ERGEBNISSE...............................................................................................................................
58
1 EXPRESSION DER /?-GLUCURONIDASE UNTER KONTROLLE DES TANDEMPROMOTORS
HSP70A/RBCS2
........
58
1.1 KLONIERUNG DER
EXPRESSIONSPLASMIDE............................................................................58
1.1.1 INTEGRATION DER 3 MTRANSLATED
REGION......................................................................58
1.1.2 INTEGRATION DES
ZIELGENS...........................................................................................
59
1.2 TRANSFORMATION DER EXPRESSIONSPLASMIDE IN CHLAMYDOMONAS REINHARDTII
..................
62
1.2.1 WACHSTUMSCHARAKTERISTIK AUSGEWAEHLTER EXPRESSIONSSTAEMME
...................................
62
1.2.2 TRANSFORMATION INS KERNGENOM VON CHLAMYDOMONAS REINHARDTU
...........................
63
1.3 EXPRESSIONSNACHWEIS DER /KHUCURONIDASE UND AUSWAHL
PRODUKTIONSSTARKER
TRANSFORMANTEN.............................................................................................................65
1.3.1 WESTERN
BLOT.............................................................................................................65
1.3.1.1 OPTIMIERUNG DER
METHODE.....................................................................................
65
1.3.1.2 ANALYSE DER
TRANSFORMANTEN.................................................................................66
1.3.2
ENZYMAKTIVITAETSTEST...................................................................................................67
1.3.2.1 OPTIMIERUNG DER
METHODE.....................................................................................
68
1.3.2.2 ANALYSE DER
TRANSFORMANTEN.................................................................................71
1.4
PROTEINPRODUKTION.........................................................................................................76
1.4.1 EINFLUSS DES
MEDIUMS................................................................................................76
1.4.2 KULTIVIERUNG IM
ERLENMEYERKOLBEN..........................................................................80
1.4.2.1
WACHSTUMSVERHALTEN..............................................................................................
81
1.4.2.2 NACHWEIS DER GENEXPRESSION AUF
RNA-EBENE......................................................81
1.4.2.3 NACHWEIS DER GENEXPRESSION AUF
PROTEINEBENE.....................................................83
1.4.3 KULTIVIERUNG IM PHOTOBIOREAKTOR SCREENING
MODUL..................................................84
1.4.3.1
PROMOTORINDUKTIONSVERSUCHE.................................................................................
84
1.4.3.2
WACHSTUMSVERHALTEN..............................................................................................
86
1.4.3.3 NACHWEIS DER GENEXPRESSION AUF
PROTEINEBENE.....................................................87
1.4.4 KULTIVIERUNG IN DER
MEDUSA......................................................................................88
1.4.4.1
WACHSTUMSVERHALTEN..............................................................................................
88
1.4.4.2 NACHWEIS DER GENEXPRESSION AUF
PROTEINEBENE.....................................................89
3 EXPRESSION DER /?-GLUCURONIDASE UNTER KONTROLLE DES PROMOTORS
PSAD
..................................
89
3.1 KLONIERUNG DER EXPRESSIONSPLASMIDE
...........................................................................
89
3.1.1 INTEGRATION DES PROMOTORS
PSAD
...............................................................................
89
3.1.2 INTEGRATION DER
3 UNTRANSLATEDREGION.....................................................................91
3.1.3 INTEGRATION DES
ZIELGENS...........................................................................................
92
3.2 TRANSFORMATION DER EXPRESSIONSPLASMIDE IN CHLAMYDOMOMS REINHARDTII
................
93
3.3 EXPRESSIONSNACHWEIS DER ^-GLUCURONIDASE UND AUSWAHL
PRODUKTIONSSTARKER
TRANSFORMANTEN.............................................................................................................
95
3.3.1 ANALYSE DER TRANSFORMANTEN MITTELS ENZYMAKTIVITAETSTEST
......................................
95
3.3.2 ANALYSE DER TRANSFORMANTEN MITTELS WESTERN B
LOT.................................................95
3.4
PROTEINPRODUKTION.........................................................................................................
96
3.4.1 EINFLUSS DES
MEDIUMS................................................................................................
96
3.4.2 PROTEINPRODUKTION BEI KULTIVIERUNG IM ERLENMEYERKOLBEN
......................................
98
3.4.2.1
WACHSTUMSVERHALTEN..............................................................................................
99
3.4.2.2 NACHWEIS DER GENEXPRESSION AUF RNA-EBENE
.....................................................
99
3.4.2.3 NACHWEIS DER GENEXPRESSION AUF
PROTEINEBENE...................................................100
4 VERGLEICH DER
PSAD UND TANDEMPROMOTOR HSP70A/RBCS2 REGULIERTEN PROTEINPRODUKTION
.........
SOWIE DES WACHSTUMSVERHALTENS DER TRANSFORMANTEN
...........................................................
101
5
GLYKANANALYTIK......................................................................................................................
102
5.1 KOMPOSITIONSANALYSE DER ISOLIERTEN IV-GLYKANE
.........................................................
102
5.1.1 ENTWICKLUNG EINER GC-MS METHODE ANHAND VON
STANDARD-ALDITOLACETATEN
.......
103
5.1.2 BESTIMMUNG DER NACHWEIS- UND BESTIMMUNGSGRENZEN ANHAND VON
.........................
STANDARD-ALDITOLACETATEN
........................................................................................
104
5.1.3
PROBENVORBEREITUNG................................................................................................
105
5.1.3.1
WIEDERFINDUNGSRATEN............................................................................................
105
5.1.3.2 TEST VERSCHIEDENER METHODEN ZUR SAUREN HYDROLYSE VON LAKTOSE
.....................
106
5.2 STRUKTURANALYSE DER V-GLYKANE MITTELS EXOGLYCOSIDASE-VERDAUS
..............................
107
5.2.1 KAL IBRIERGERADE ANHAND EINER
DEXTRAN LADDER...............................................107
5.2.2 EXOGLYCOSIDASEVERDAU VON MAN9
...........................................................................
108
5.2.3 EXOGLYCOSIDASEVERDAU VON NA 3
..............................................................................
110
E
DISKUSSION..............................................................................................................................
112
1 EXPRESSION DER /?-GLUCURONIDASE IN CHLAMYDOMONAS REINHARDTII
..........................................
112
1.1 BEWERTUNG DER
EXPRESSIONSPLASMIDE............................................................................
112
1.2 TRANSFORMATION DER EXPRESSIONSPLASMIDE IN CHLAMYDOMONAS REINHARDTII
..................
114
1.2.1 AUSWAHL DER
EXPRESSIONSSTAEMME............................................................................114
1.2.2 TRANSFORMATION IN DAS
KEMGENOM..........................................................................115
1.3 EXPRESSIONSNACHWEIS UND AUSWAHL DER TRANSFORMANTEN
...........................................
117
1.3.1 WESTERN
BLOT...........................................................................................................
117
1.3.2
ENZYMAKTIVITAETSTEST.................................................................................................
120
1.4 PROTEINPRODUKTION
..................................
...................................................................125
1.4.1 EINFLUSS DES
MEDIUMS.............................................................................................
125
1.4.2 KULTIVIERUNG IN VERSCHIEDENEN
BIOREAKTOREN...........................................................126
1.4.3 VERGLEICH DERPSAD UND TANDEMPROMOTOR
HSP70A/RBCS2 REGULIERTEN
PROTEINPRODUKTION...................................................................................................
129
1.4.4
PROMOTORINDUKTIONSVERSUCH....................................................................................
131
2
GLYKANANALYTIK......................................................................................................................
132
3 BEWERTUNG VON CHLAMYDOMONAS REINHARDTII ALS
EXPRESSIONSSYSTEM....................................135
4
SENSITIVITAETSANALYSE................................................................................................................
136
F
LITERATURVERZEICHNIS..............................................................................................................
XI
G
ANHANG..............................................................................................................................
XXIV
1
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.....................................................................................................XXIV
2
ABBILDUNGSVERZEICHNIS......................................................................................................XXVI
3 T
ABELLENVERZEICHNIS...........................................................................................................XXIX
4
FORMELVERZEICHNIS.............................................................................................................XXXI
5
PLASMIDKARTEN..................................................................................................................
XXXII
5.1 PLASMID
12ABLAPP-1264543.............................................................................
XXXII
5.2 PLASMID
PXX273.................................................................................................XXXIII
5.3 PLASMIDAUSSCHNITT
PGEND-BLE.............................................................................XXXIV
5.4 PLASMID
PCL-JROL...............................................................................................XXXIV
5.5 PLASMID
PCL-JR02................................................................................................
XXXV
5.6 PLASMID
PCL-JR03...............................................................................................XXXVI
5.7 PLASMID
PCL-JR16.............................................................................................
XXXVII
5.8 PLASMID
PCL-JR17............................................................................................
XXXVIII
5.9 PLASMID
PCL-TT05..............................................................................................XXXIX
5.10 PLASMID
PCL-TT06......................................................................................................XL
5.11 PLASMID
PCL-TT07....................................................................................................
XLI
5.12 PLASMID
PCL-TT08...................................................................................................
XLII
6
GENSEQUENZEN.....................................................................................................................XLIII
6.1 GENSEQUENZ DER
SSGUS................................................................................................
XLIII
6.2 SEQUENZEN DER REFERENZGENE FUER RT-QPCR
...........................................................
XLIV
6.2.1 SS- ACTIN (SS-ACTIN)
.................................................................................................
XLI V
6.2.2 GLYCERINALDEHYD-3-PHOSPHAT-DEHYDROGENASE (GAPDH)
.......................................
XLIV
6.2.3 188 RIBOSOMALE UNTEREINHEIT (18S RRNA)
...........................................................
XLIV
6.2.4 CHLAMYDOMONAS BETA SUBUNIT-LIKE POLYPEPTIDE
(CBLP)........................................XLIV
7 MULTI-TAG
PROTEIN.................................................................................................................XLV
8 KOMPOSITIONSANALYSE DER ISOLIERTEN V-GLYKANE
................................................................
XLVI
9 PROTEINAUSBEUTEN VERSCHIEDENER TRANSFORMANTEN BEI KULTIVIERUNG IN
.......................................
PHOTOBIOREAKTOR SCREENING
MODULEN................................................................................
XLVII
9.1 PROTEINAUSBEUTE DER TRANSFORMANTE PC 1-JR17 300-6
............................................
XLVII
9.2 PROTEINAUSBEUTE DER TRANSFORMANTE PC 1-JR17 300-12
.......................................
XLVIII
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