Immunmodulation durch Aktivierung endogener tolerogener Signalwege:
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Berlin
2017
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|---|---|
| adam_text | 1. INHALTSVERZEICHNIS
INHALT
1.
INHALTSVERZEICHNIS...............................................................................
2.
DANKSAGUNG........................................................................................
3. ZUSAMMENFASSUNG
.............................................................................
4. EINLEITUNG
............................................................................................
4.1. GRUNDLAGEN DES IMMUNSYSTEMS
...............................................
4.2. T-ZELLEN; AKTIVIERUNG UND DIFFERENZIERUNG DER CD4+ T-ZELLEN
4.3. KONZEPT T-ZELL TOLERANZ
.............................................................
4.3.1. NEGATIV SELEKTION
................................................................
4.3.2. TOLERANZ DURCH AKTIVE SUPPRESSION
..................................
4.4.
AUTOIMMUNERKRANKUNGEN.........................................................
4.5.
TOLERANZINDUKTION.......................................................................
4.5.1. ANTIGEN-UNSPEZIFISCHE IMMUNMODULATION......................
4.5.2. IMMUNMODULATION DURCH WURMPARASITEN......................
4.5.3. ANSAETZE ZUR ANTIGEN-SPEZIFISCHEN TOLERANZINDUKTION ....
4.5.4. TOLERANZ DURCH LOESLICHE
PEPTIDE.......................................
4.5.5.
GLATIRAMERACETAT................................................................
4.6. APOPTOSE ALS TOLERISIERUNGSMECHANISMUS
.............................
4.6.1. PHAGOZYTOSE VON APOPTOTISCHEN ZELLEN
...........................
4.6.2. EIGENSCHAFTEN DES GAS6
PROTEINS.....................................
4.6.3. EIGENSCHAFTEN DER TAM REZEPTOREN
...............................
4.6.4. FUNKTION VON GAS6 BEI DER EFFEROZYTOSE.........................
4.6.5. IMMUNMODULATION DURCH
GAS6........................................
4.6.6. SYSTEMISCHE AUSWIRKUNGEN BEIM AUSFALL DER TAM REZEPTOR SIGNALE
4.7.
ZIELSTELLUNG.......................................................................................................
5.
MATERIALIEN..............................................................................................................
5.1. GERAETE, INSTRUMENTE,
SOFTWARE.....................................................................
5.2. CHEMIKALIEN, REAGENZIEN, MEDIEN, PUFFER UND VERBRAUCHSMATERIAL
........
5.3. ANTIKOERPER, REKOMBINANTE PROTEINE, PEPTIDE
.............................................
5.4. ZELLLINIEN UND
VEKTOREN..................................................................................
5.5.
MAEUSE...............................................................................................................
6.
METHODEN................................................................................................................
5
6
7
7
7
9
9
10
11
13
13
13
14
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19
20
21
22
22
24
25
25
27
34
36
37
38
6.1. ZUSAMMENFASSUNGEN DER GAS6-0VA
PRODUKTIONEN.....................................................
6.1.1. EUKARYOTISCHE PRODUKTION DES
B-GAS6-OVA..........................................................
6.1.2. PROKARYOTISCHE PRODUKTION DES
B-GAS6-OVA........................................................
6.1.3. PRODUKTION VON GAS6-OVA BEI DER FIRMA IN VIVO
..................................................
6.1.4. PRODUKTION VON GAS6-OVA BEI DER FIRMA NOVO NORDISK
.....................................
6.2.
PROLIFERATIONS-ASSAYS.......................................................................................................
6.2.1. IN VITRO
PROLIFERATIONS-ASSAY....................................................................................
6.2.2. ADOPTIVER T-ZELL
TRANSFER.........................................................................................
6.2.3. ADOPTIVER TRANSFER VON THL
ZELLEN..........................................................................
6.3. KONKRETE
ARBEITSSCHRITTE..................................................................................................
6.3.1. TRANSFORMATION VON E. COLI ZUR VERMEHRUNG UND SELEKTION VON
PLASMID DNA..
6.3.2. TRANSFEKTION UND KULTUR VON COS-7
ZELLEN............................................................
6.3.3. METALLCHELATCHROMATOGRAPHIE DES B-GAS6-OVA
..................................................
6.3.4.
AMMONIUMSULFATFAELLUNG..........................................................................................
6.3.5. PUFFERAUSTAUSCH MITTELS
GELFILTRATION.....................................................................
6.3.6.
STERILFILTRATION...........................................................................................................
6.3.7. ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY FOR GAS6
...................................................
6.3.8.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE....................................................................................
6.3.9. QUALITATIVER NACHWEIS VON PROTEINEN
...................................................................
6.3.10. ERGEBNISSE LAL TESTS BEI DEN LAB-MANAGERN
...................................................
6.3.11. KLONIERUNG DES GAS6-OVA IN DEN E. COLI PRODUKTIONSVEKTOR PGEX-2T
............
6.3.12. TRANSFORMATION VON F. COLI ZUR
PRODUKTION........................................................
6.3.13. AUFSCHLUSSBEMUEHUNGEN VON GAS6-OVA AUS E.
COLI..........................................
6.3.14. PRAEPARATION VON MURINEN
ZELLSUSPENSIONEN......................................................
6.3.15. SORTIEREN VON
ZELLEN.............................................................................................
6.3.16. DURCHFLUSSZYTOMETRIE UND VERSCHIEDENE
FAERBUNGEN.......................................
6.3.16.1.
OBERFLAECHENFAERBUNG............................................................................................
6.3.16.2. CFSE
FAERBUNG......................................................................................................
6.3.16.3. FOXP3
FAERBUNG....................................................................................................
6.3.16.4. ZYTOKINFAERBUNG MIT IN VITRO RESTIMULATION
..........................................................
6.3.17. ECDI VERMITTELTE KOPPLUNG VON ANTIGEN (POVA) AN ZELLEN
.............................
6.3.18. IN VITRO THL
POLARISIERUNG.....................................................................................
6.3.19. BESCHICHTUNG UND FAERBUNG VON MIKROPARTIKELN
...............................................
6.3.20. STREPTAVID
IN-AGGREGATE........................................................................................
38
38
39
40
41
42
42
43
43
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56
57
57
58
59
59
60
6.3.21. T-ZELL STIMULATION MITTELS ANTI-CD28 & ANTI-CD3 ANTIKOERPERN
.......................
60
6.3.22. MESSUNG VON ZYTOKINEN IM ZELLKULTURUEBERSTAND
...............................................
61
6.3.23. PRODUKTION DES AS-ESP DURCH DAS HARTMANN
LABOR..........................................61
6.3.24. STATISTISCHE
ANALYSE...............................................................................................62
7.
ERGEBNISSE.................................................................................................................................
64
7.1. KOPPLUNG VON ANTIGENEN AN TOLEROGENE LIGANDEN DES APOPTOTISCHEN
ABBAUPROZESSES.
.............................................................................................................................................
64
7.1.1. TESTUNG VON
B-GAS6-OVA.........................................................................................
65
7.1.2. CHARAKTERISIERUNG DES TOLERISIERUNGSANSATZES ANTIGENE MITTELS
ECDI AN ZELLEN
ZU KOPPELN IM 0011.10
MODELL................................................................................72
7.1.3. EVALUATION VON EXTERN PRODUZIERTEM
GAS6-OVA....................................................78
7.1.4. AUSSCHLUSS VON URSACHEN FUER DIE DIFFERENZIELLE IN VITRO WIRKUNG
DER GAS-OVA
CHARGEN......................................................................................................................
82
7.2. IMMUNMODULATION DURCH EXKRETIERTE/SEKRETIERTE MOLEKUELE VON
WURMPARASITEN... 89
8.
DISKUSSION..................................................................................................................................
98
8.1. WIRKUNG VON
B-GAS6-OVA................................................................................................
98
8.1.1. FUNKTIONALITAET B-GAS6-OVA IN VITRO: INDUKTION VON
PROLIFERATION........................98
8.1.2. FUNKTIONALITAET B-GAS6-OVA IN VITRO:
IMMUNMODULATION.......................................99
8.1.3. FUNKTIONALITAET B-GAS6-OVA IN VIVO: INDUKTION VON
PROLIFERATION.........................99
8.1.4. FUNKTIONALITAET B-GAS6-OVA IN VIVO: INTERPRETATION DER
IMMUNMODULATION .... 101
8.2. MOEGLICHE ZUKUENFTIGE VERSUCHE UM DIE ERFOLGREICHE TOLERISIERUNG MIT
B-GAS6-OVA ZU
EVALUIEREN............................................................................................................................103
8.3. NOTWENDIGKEIT EXTERNER GAS6-OVA PRODUKTION
..........................................................
104
8.4. UNTERSCHIEDLICHE WIRKUNG VON N-GAS6-OVA UND B-GAS6-OVA
................................
105
8.5. MOEGLICHE ERKLAERUNGEN FUER DIE UNTERSCHIEDE ZWISCHEN B-GAS6-OVA UND
N-GAS6-OVA.
..........................................................................................................................................106
8.5.1.
AMINOSAEURENSEQUENZ..............................................................................................106
8.5.2. BEEINFLUSSUNG DER FUNKTIONALITAET DURCH DEN HERSTELLUNGSPROZESS
...................
107
8.5.3. ZUSAMMENFASSUNG ERKLAERUNG DER MOEGLICHEN
UNTERSCHIEDE..............................110
8.6. WICHTIGKEIT DER GLA-DOMAENE FUER DIE FUNKTIONALITAET DES GAS6
.................................
111
8.7. FAZIT DES TOLERISIERUNGSANSATZES MIT GAS6-OVA PROTEIN
............................................
112
8.8. IMMUNMODULATION MIT
AS-ESP.......................................................................................
114
8.8.1. LITERATURVERGLEICH DES AS-ESP MIT PAS-1
..............................................................
114
8.8.2. WIRKUNG VON AS-ESP AUF
APC..................................................................................115
8.8.3. DE NOVO INDUKTION VON FOXP3+ ZELLEN IN
VITRO......................................................116
8.8.4. EINSCHRAENKUNG DER AKTIVEN KOMPONENTEN IM
AS-ESP........................................117
8.8.5. FAZIT ZUM
AS-ESP......................................................................................................117
9.
LITERATURVERZEICHNIS...............................................................................................................
119
10.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.......................................................................................................135
11.
ABBILDUNGSVERZEICHNIS........................................................................................................138
12.
TABELLENVERZEICHNIS............................................................................................................
139
13.
ANHANG..................................................................................................................................140
13.1. DNA SEQUENZ FUER DIE B-GAS6-OVA PRODUKTION IN COS-7 ZELLEN
................................
140
13.2. DNA-SEQUENZ FUER GAS6-OVA FUER DIE PRODUKTION IN E. COLI:
.......................................
140
13.3. KONZENTRATIONEN EINZELNER HPLC FRAKTIONEN DES AS-ESP
.........................................
142
14.
SELBSTSTAENDIGKEITSERKLAERUNG..............................................................................................
143
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