Untersuchung von Rezeptoren und G-Proteinen mittels Einzelmolekülfluoreszenztechniken: = Investigation of receptors and G-proteins using single molecule fluorescence techniques
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Würzburg
2015
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| adam_text | UNTERSUCHUNG VON REZEPTOREN UND G-PROTEINEN
MITTELS EINZELMOLEKUELFLUORESZENZTECHNIKEN
INVESTIGATION OF RECEPTORS AND G-PROTEINS
USING SINGLE MOLECULE FLUORESCENCE TECHNIQUES
DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES NATURWISSENSCHAFTLICHEN DOKTORGRADES
DER GRADUATE SCHOOL OF LIFE SCIENCES,
JULIUS-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET WUERZBURG,
KLASSE BIOMEDIZIN
VORGELEGT VON
JULIA WAGNER
AUS
WEIMAR
WUERZBURG, 2015
INHALTSVERZEICHNIS
Z U S A M M E N FA S S U N G
........................................................................................................................................
1
S U M M A R Y
............................................................................................................................................................
3
1 E IN LE ITU N G
.....................................................................................................................................................5
1.1 G-PROTEIN-GEKOPPELTE REZEPTOREN (G P C R
).......................................................................................5
1.2
G-PROTEINE...............................................................................................................................................
5
1.3 VERWENDETE GPCR UND
G-PROTEINE.....................................................................................................7
1.3.1 GAS-PROTEINE UND GAS-GEKOPPELTE REZEPTOREN
..........................................................................
7
1.3.2 GDRPROTEINE UND GAR GEKOPPELTE
REZEPTOREN.............................................................................7
1.3.3
GSSY-PROTEINE......................................................................................................................................
8
1.4 MOTIVATION: VOM ENSEMBLE ZUM
EINZELMOLEKUEL.................................................................................
9
1.5
ZIELSETZUNG............................................................................................................................................10
2 M A TE R IA LIE N
................................................................................................................................................
11
2.1 BIOLOGISCHES
MATERIAL...........................................................................................................................
11
2.2 CHEMIKALIEN, REAGENZIEN, MEDIEN, PUFFER, LOESUNGEN,
KITS...........................................................13
2.3 GEBRAUCHS- UND VERBRAUCHSMATERIALIEN, GERAETE,
SOFTWARE.......................................................... 17
3 M E TH O D E N
..................................................................................................................................................
21
3.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN.......................................................................................................
21
3.2 PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN........................................................................................................
22
3.3 ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN/ZELLKULTUR..................................................................................................23
3.4 METHODEN DER
FLUORESZENZMARKIERUNG............................................................................................
26
3.4.1 GRUNDLAGEN DER
FLUORESZENZ........................................................................................................
26
3.4.2 FLUORESZIERENDE
PROTEINE.............................................................................................................29
3.4.3 FLUORESZENZMARKIERUNG MIT SA/AP/CL/P-FARBSTOFFEN
..............................................................
30
3.5
FLUORESZENZVERFAHREN.........................................................................................................................32
3.5.1 INTERNE TOTALREFLEXIONSFLUORESZENZMIKROSKOPIE
(TIRF-M)........................................................32
3.5.2
EINZELMOLEKUELVERFOLGUNG...............................................................................................................33
3.5.2.1
PARTIKELDETEKTION....................................................................................................................
33
3.5.2.2
PARTIKELVERFOLGUNG..................................................................................................................34
3.5.2.3 CHARAKTERISIERUNG DER DIFFUSION
..........................................................................................
35
3.5.3 FLUORESZENZ-KORRELATIONS-SPEKTROSKOPIE (FCS) UND
FLUORESZENZ-KREUZKORRELATIONS-
SPEKTROSKOPIE
(FCCS)..................................................................................................................36
3.5.3.1
FCS-AUFBAU............................................................................................................................37
3.5.3.2 PRINZIP DER
KORRELATIONSANALYSE...........................................................................................38
3.5.3.3 AUFLOESUNGSVERMOEGEN DES FCS-VERSUCHSAUFBAUS
...........................................................
44
3.5.34
FLUORESZENZ-KREUZKORRELATIONSANALYSE.............................................................................
44
3.5.3 5 KONFOKALE VERSUS EVANESZENTE FLUORESZENZANREGUNG FUER DIE F(C )C
S
........................
48
3.5.3.6
FITFUNKTIONEN..........................................................................................................................
49
3.5.4
ZUSAMMENFASSUNG........................................................................................................................51
4 E RG E B N IS S E
..............................................................................................................................................
53
4.1 FLUORESZENZMARKIERUNG VON REZEPTOREN UND G-PROTEINEN UNTER
VERWENDUNG DER
S/VAP/CL/P-METHODE..........................................................................................................................53
4.1.1 KLONIERUNGSSTRATEGIE UND
FUNKTIONALITAETSTESTS..........................................................................53
4.1.2 OPTIMIERUNG DER
TRANSFEKTION.....................................................................................................
53
4.1.3 MARKIERUNG MIT
SNAP/CUP
-FARBSTOFFEN...................................................................................54
4.2 VISUALISIERUNG VERSCHIEDENER REZEPTOREN UND G-PROTEINE MITTELS
ZEITAUFGELOESTER
EINZELMOLEKUELMIKROSKOPIE..................................................................................................................
61
4.2.1
AUFBAU............................................................................................................................................61
4.2.2 DURCHFUEHRUNG DER TIRF-EINZELMOLEKUELEXPERIMENTE
..........................
61
4.3 BESTIMMUNG DER DIFFUSIONSKOEFFIZIENTEN VON REZEPTOREN UND
G-PROTEINEN MITTELS
MASSGESCHNEIDERTER ALGORITHMEN ZUR EINZELMOLEKUELVERFOLGUNG
.....................................................
62
4.3.1 BILDBEARBEITUNG MIT
IMAGEJ.........................................................................................................62
4.3.2 DATENAUSWERTUNG MIT
U-FRACK/MATLAB.........................................................................................
63
4.3.3 CHARAKTERISIERUNG DES
DIFFUSIONSVERHALTENS.............................................................................
63
4.4 ETABLIERUNG EINES F(C)CS-VERSUCHSAUFBAUS ZUR ANALYSE SCHNELLER
REZEPTORDYNAMIKEN
....
67
4.4.1 DIE KONFOKALE
F(C)CS..................................................................................................................
67
4.4.1.1
AUFBAU....................................................................................................................................
67
4.4.
1.2
KALIBRIERUNG DES
FCS-SYSTEMS...........................................................................................
68
4.4.1.3 KALIBRIERUNG DES
FCCS-SYSTEMS.........................................................................................71
4.4.
1
.4 AUFKLAERUNG VON REZEPTORDYNAMIKEN MIT KONFOKALER
FCS................................................
74
4.4.2 ERWEITERUNG: FCS IM TIRF MODUS
(TIR-FCS)..........................................................................80
4.4.2
.1
ERWEITERTER EXPERIMENTELLER AUFBAU FUER DIE INTERNE TOTALREFLEXIONS-
FLUORESZENZANREGUNG
..........................................................................................................80
4.4.2
.2
KALIBRIERUNG DES TIR-FCS
SYSTEMS....................................................................................80
4.4.2.3 AUFKLAERUNG VON REZEPTORDYNAMIKEN MIT EVANESZENTER
FCS...........................................81
5 D ISK U S S IO N
...............................................................................................................................................
85
5.1 DIFFUSIONSANALYSE MITTELS BILDGEBENDER
EINZELMOLEKUELVERFOLGUNG...............................................85
5.2 DIFFUSIONSANALYSE MITTELS FLUORESZENZ-KORRELATIONS-SPEKTROSKOPIE
...........................................
87
5.3 BEWERTUNG DER VERWENDETEN
VERFAHREN..........................................................................................
91
5.4
AUSBLICK................................................................................................................................................
93
6
R E FE R E N Z E N
..............................................................................................................................................
95
7 A B K UE RZ U N G S V E RZ E IC H N IS
....................................................................................................................
107
8
P U B LIK A TIO N E N /K O N FE RE N Z B E ITRAE G E
................................................................................................
109
8.1
PUBLIKATIONEN......................................................................................................................................109
8.2
KONFERENZBEITRAEGE.............................................................................................................................
109
9 D A N K S A G U N G
..........................................................................................................................................
M
10 C U RRICU LU M V ITA E
............................................................................................................................
113
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