Genetische Diversität von Helicobacter pylori als Konsequenz einer mikroaeroben und neutrophilen Lebensweise:
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Berlin
2016
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS.I
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.
IV
ABBILDUNGSVERZEICHNIS.
V
TABELLENVERZEICHNIS.VI
1
EINLEITUNG.1
1.1 ENTDECKUNG VON H. PYLORI UND PHYLOGENETISCHE EINORDNUNG
.
1
1.2 BEDEUTUNG VON H. PYLORI FUER DEN MENSCHEN
.
2
1.3 BESIEDELUNG DES EXTREMHABITATS
MAGEN.
5
1.4 NATUERLICHE T
RANSFORMATION.
7
1.5 GENETISCHE
DIVERSITAET.
11
1.6 ZENTRALE FRAGESTELLUNGEN DER ARBEIT UND ANGESTREBTE ZIELE
.
14
2 MATERIAL UND
METHODEN.15
2.1 BAKTERIENSTAEMME UND
PLASMIDE.15
2.2 KULTIVIERUNG UND LAGERUNG DER
BAKTERIEN.16
2.2.1 HELICOBACTER
PYLORI.16
2.2.2 ESCHERICHIA
COLI.17
2.3 ISOLIERUNG VON GENOMISCHER DNA UND PLASMID-DNA
.
17
2.3.1 ISOLIERUNG CHROMOSOMALER DNA
.
17
2.3.2 ISOLIERUNG VON
PLASMID-DNA.18
2.4
DNA-FAELLUNG.18
2.5 KONZENTRATIONS- UND QUALITAETSBESTIMMUNG DER D N A
.
19
2.6
POLYMERASE-KETTENREAKTION.19
2.6.1 STANDARD P C R
.20
2.6.2
FUSIONS-PCR.20
2.6.3 DIREKTE PCR VON
BAKTERIENKOLONIEN.
22
2.7 ANALYTISCHE UND PRAEPARATIVE
GELELEKTROPHORESE.
23
2.8 DNA-REINIGUNG AUS ENZYMATISCHEN
REAKTIONEN.23
2.9 HERSTELLUNG VON *KNOCKOUT*
MUTANTEN.
24
2.9.1 KONSTRUKTION DER H.
PYLORI-MUTANTEN.
24
2.9.1.1 DELETIONSMUTANTEN (AKATA, ASODB, ANUCT UND ACOMH)
.
24
2.9.1.2 KOMPLEMENTATIONSMUTANTEN (*6*COMHL UND N6ACOMHH)
.
25
2.9.1.3 WEITERE DELETIONSMUTANTEN (N6ACOMSS4,
*6*COMB6).26
2.9.2 DOPPELTER RESTRIKTIONSVERDAU UND
LIGATION.26
2.9.3
TOPO-T/A-KLONIERUNG.27
2.9.4 TRANSFORMATION VON PLASMIDEN IN E. COLI TO P10
.
28
2.10 NATUERLICHE TRANSFORMATION
.
29
2.10.1 NATUERLICHE TRANSFORMATION ZUR HERSTELLUNG VON H. PYLORI-MUTANTEN
.
29
2.10.2 BESTIMMUNG DER TRANSFORMATIONSRATEN
.
29
2.11
SEQUENZIERUNG.30
2.12 MIKROSKOPISCHE
UNTERSUCHUNGEN.
30
2.12.1 FLUORESZENZMARKIERUNG DER DNA
.
31
2.12.1.1 KOVALENTE FLUORESZENZMARKIERUNG
.
31
2.12.1.2 NICHT KOVALENTE FLUORESZENZMARKIERUNG
.
32
2.12.2 DNA-AUFNAHME IN H.
PYLORI.32
2.12.3 FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE
AUSWERTUNG.33
2.12.4 QUANTIFIZIERUNG DER IMPORTIERTEN *-D N A
.
34
2.13 WACHSTUMSVERSUCHE IM MINIMALMEDIUM
.
35
2.14 VERAENDERUNG DER KOMPETENZENTWICKLUNG IM
WACHSTUMSVERLAUF.35
3
ERGEBNISSE.
37
3.1 REGULATION DER TRANSFORMATION UEBER DIE AEUSSERE
MEMBRAN.37
3.2 INHIBITION DES
DNA-TRANSPORTS.39
3.3 QUANTITATIVE ANALYSE DER DNA-AUFNAHME UNTER MIKROAEROBEN BEDINGUNGEN
.
42
3.4 KOMPETENZENTWICKLUNG WAEHREND DES MIKROAEROBEN WACHSTUMS
.
45
3.4.1 ROLLE DER DNA ALS MOEGLICHE
PURINQUELLE.45
3.4.2 EINFLUSSGROESSEN, DIE DIE KOMPETENZENTWICKLUNG IN
H. PYLORI MODULIEREN. 47
3.5 KOMPETENZENTWICKLUNG ALS REAKTION AUF OXIDATIVEN
STRESS.51
3.5.1 ZEITLICHE ENTWICKLUNG DER KOMPETENZ UNTER AEROBEN BEDINGUNGEN
.
51
3.5.2 UNTERSUCHUNGEN VON H. PYLORI-MUTANTEN MIT FEHLENDER KATALASE- BZW.
SUPEROXIDDISMUTASEAKTIVITAET
.
53
3.5.2.1 M A KATA
.
53
3.5.2.2
NSSASODB.
54
3.6 EINFLUSS DES PH-WERTES AUF DIE KOMPETENZ VON H. PYLORI
.
57
3.6.1 EINFLUSS DES PH-WERTES AUF DIE AKTIVITAET DES DNA-TRANSPORTES BEI
KOMPETENTEN
ZELLEN.
57
3.6.2 EINFLUSS DES PH-WERTES AUF DIE
KOMPETENZENTWICKLUNG.58
3.7 ANWENDUNG DER EINZELZELL-FLUORESZENZANALYSE FUER DIE UNTERSUCHUNG VON
KOMPONENTEN, DIE MOEGLICHERWEISE EINE ROLLE BEI DER DNA-AUFNAHME SPIELEN
. 63
3.7.1 IN VIVO NACHWEIS EINER PERIPLASMATISCHEN DNASE-AKTIVITAET VON NUCT
.
63
3.7.2 BETEILIGUNG VON COMH AM DNA-TRANSPORT UEBER DIE AEUSSEREN MEMBRAN.
65
3.8
PUBLIKATIONEN.
68
4
DISKUSSION.
69
4.1 CHARAKTERISIERUNG DER NATUERLICHER
TRANSFORMATION.69
5
6
7
8
4.1.1 AKTIVE DNA-AUFNAHME IN DAS PERIPLASMA UND TRANSFORMATIONSRATE
.
69
4.1.2 ANWENDUNG DER EINZELZELL-FLUORESZENZANALYSE FUER DIE UNTERSUCHUNG
VON
NUCT- UND
COMH-DELETIONSMUTANTEN.71
4.2 QUANTIFIZIERUNG DER PERIPLASMATISCH AUFGENOMMENEN D N A
.73
4.3 UNTERSUCHUNGEN ZUR KOMPETENZENTWICKLUNG VON H.
PYLORI.74
4.3.1 KOMPETENZ WIRD IN H. PYLORI DURCH OXIDATIVEN STRESS BEEINFLUSST
.
75
4.3.2 EIN NEUTRALER PH-WERT IST ENTSCHEIDEND FUER DIE
KOMPETENZENTWICKLUNG IN
H.
PYLORI.
77
4.4 DNA-SCHAEDEN ALS MOEGLICHER AUSLOESER DER
DNA-AUFNAHME.79
4.5 IDENTIFIKATION EINES PH-DEFINIERTEN *KOMPETENZFENSTERS*
.
80
4.6 BEDEUTUNG DER ERGEBNISSE FUER DAS NATUERLICHE
HABITAT.81
4.7
SCHLUSSFOLGERUNG.84
ZUSAMMENFASSUNG.
85
SUMMARY.87
LITERATUR.89
ANHANG ZU
MATERIAL.
102
8.1 VERBRAUCHSMATERIALIEN, GERAETE UND HILFSMITTEL SOWIE VERWENDETE KITS
.
102
8.2 CHEMIKALIEN, REAGENZIEN UND
ENZYME.
104
8.3 NAEHRMEDIEN UND PUFFERLOESUNGEN
.
106
8.4
OLIGONUKLEOTIDE.
108 |
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