Der proteinvermittelte Transport des kardiovaskulären Risikofaktors asymmetrisches Dimethylargenin und strukturähnlicher Substanzen:
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Erlangen ; Nürnberg
2016
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| Beschreibung: | XII, 160 Seiten Illustrationen, Diagramme |
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|---|---|
| adam_text | DER PROTEINVERMITTELTE TRANSPORT DES KARDIOVASKULAEREN
N UND
*N*
METHYLARG
*
RISIKOFAKTORS ASYMMETRISCHES D
^
STRUKTURAEHNLICHER S U B S TA
DER NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET
DER FRIEDRICH-ALEXANDER-UNIVERSITAT
ERLANGEN-NUERNBERG
ZUR
ERLANGUNG DES DOKTORGRADES D R RER NAT.
VORGELEGT VON
JOACHIM STROBEL
AUS SULZBACH-ROSENBERG
NHALTSVERZEICHNIS
*
I
.............................................................................................................
IN H A L T S V E R Z E IC H N IS
VI
................................................................................................
TA B E L L E N V E R Z E IC H N IS
VII
..........................................................................................
AB B IL D U N G S V E R Z E IC H N IS
IX
..............................................................................................
AB K UE R Z U N G S V E R Z E IC H N IS
1
...............................................................................................................................................
1
ZU S A M M E N F A S S U N G
7
..............................................................................................................................................
2
S U M M A R Y
13
...........................................................................................................................................
3
EIN L E IT U N G
13
**********
3.1
HERZ-KREISLAUF-ERKRANKUNGEN - DIE HAEUFIGSTE TODESURSACHE
3.2
DIE ENDOTHELIALE DYSFUNKTION ALS GEMEINSAMES KENNZEICHEN VIELER
14
........................................................................................
VASKULAERER ERKRANKUNGEN
14
*************
3.3
STICKSTOFFMONOXID * EIN ESSENTIELLER BOTENSTOFF DES ENDOTHELS
15
.................................................................................
3.4
DIE BILDUNG VON NO DURCH NO-SYNTHASEN
15..
.....
VATE
*
DER
*N*N*
A*G
*3.5
DIE HEMMUNG DER NO-SYNTHASEN DURCH METHYLIERTE L
16
....................................................................................................................
3.5.1
L_ARGININ
3.5.2
DE METHYLIERTEN L-ARQININ-DERIVATE NMMA
*
ADMA UND SDMA ALS ENDOGENE
HEMMSTOFFE DER
18
VATE
*
N-DER
*N*3.6
GENESE UND METABOLISMUS DER ENDOGENEN L
*
ARG
18
. .
..
3.6.1
GENESE ENDOGENER L-ARGININ-DERIVATE UND BEDEUTUNG DER PRMT
19
...........................................................
36 .2
METABOLISMUS ENDOGENER L-ARGJNIN-DERIVATE
22..
............................
3.7
TRANSPORT VON ADMA UND STRUKTURAEHNLICHEN SUBSTANZEN
23
.......
3.7.1
TRANSPORTMECHANISMEN VON ADMA UND STRUKTURAEHNLICHEN SUBSTANZEN
3.7.2
REGULATION DES GLEICHGEWICHTS INTRAZELLULAERER UND EXTRAZELLULAERER
25
..........................................................................................................
METHYLARGINLNE
26
..........*...................*...*............................
3.7.3
KATIONISCHE AMINOSAEURETRANSPORTER
26
.................................................
)
3.7.3.1
DER KATIONISCHE AMLNOSAURETRANSPORTER 1 (CAT1
27
)
37.3.2
DER KATIONISCHE AMINOSAEURETRANSPORTER 2 (CAT2A UND CAT2B
28
.................................................................................
37 .4
ORGANISCHE KATIONENTRANSPORTER
29
.....................................................
)
3.7.4.1
DER ORGANISCHE KATIONENTRANSPORTER 1 (O C TI
29
............................................................
)
3.7.4.2
DER ORGANISCHE KATIONENTRANSPORTER 2 (0CT2
30
.......................................
)
3.7.5
DAS
MULTIDRUG AND TOXIN EXTRUSION PROTEIN
1 (M A TE I
4 Z IE L S T E L L U N G E N
......................................................................................................32
5 M A TE R IA L UND M E T H O D E N
.................................................................................
34
5.1 M
ATORIALIAN........................................................................................................................34
R
1 1
CHEMIKALIEN...................................................................................................................
34
5.1.2 RADIOAKTIV MARKIERTE
*
STABIL-LSOTOPEN-MARKIERTE UND UNMARKIERTE
CHEMIKALIEN FUER TRANSPORTVERSUCHE
.
..........................................................................35
5.1.3 REAKTIONSSYSTEME (KIT SYSTEM
E)...............................................................................36
5.1.4
ZELLEN...............................................................................................................................36
*
.1
*.
ANTIKOERPER.......................................................................................................................37
5.1.6 SPEZIFISCHE OIGONUKLEOTID-PRIM
ER.............................................................................37
5.1.7
PLASMIDE.........................................................................................................................38
5.1.8
RESTRIKTIONSENZYME.......................................................................................................38
5.1.9 GERAETE UND
SOFTWARE....................................................................................................
39
1.10.*
VERBRAUCHSMATERIALIEN.................................................................................................
40
5.2
ZELLKULTIVIERUNG................................................................................................................41
5.3 KLONIERUNG VON
SLC7A1-, SLC7A2A-
UND
SLC7A2B-CUEUA
KODIEREND FUER
DEN CAT1, CAT2A BZW.
CAET2B).................................................
**************43
5.3.1 ERSTSTRANGSYNTHESE VON
SLC7A1-, SLC7A2A-
UND
SLC7A2B-CDNA................A3
5.3.2 AMPLIFIKATION VON
SLC7A1-, SLC7A2A-
UND
SLC 7A2B-0UE I
MITTELS
POLYMERASE-KETTENREAKTION.........................................................................................
44
5.3.3 ANALYSE VON DNS MITTELS
AGAROSEGELELEKTROPHORESE.............................................44
5.3.4 PRAEPARATIVE DNS-AUFREINIGUNG MITTELS GELELEKTROPHORESE
*
DIALYSESCHLAUCH
UND
DNS-FAELLUNG..........................................................................................................
45
5.3.5 TOPO-KLONIERUNG VON
SLC7A1-, SLC7A2A-
UND
SLC7A2B-CDLU.....1......1....A^
5.3.6 TRANSFORMATION VON PCR2.1 ****-VEKTOREN IN KOMPETENTE ESCHERICHIA
COLI
BAKTERIEN........................................................................................................................46
5.3.7 HERSTELLUNG VON ESCHERICHIA
COLI-BAKTERIENKULTUREN................................................
47
5.3.8 ANALYTISCHE
PLASMIDPRAEPARATION.................................................................................
47
5.3.9 PRAEPARATIVE
PLASMIDPRAEPARATION.................................................................................
48
5.3.10 NACHWEIS EINES DNSINSERTS IN VEKTOREN DURCH HYDROLYTISCHE , V
5.3.11
SEQUENZIERUNG...............................................................................................................
50
5.3.12 COMPUTERGESTUETZTE AUSWERTUNG DER SEQUENZIERUNGSERGEBNISSE
********.***50
5.3.13 UMKLONIERUNG VON DNS-FRAGMENTEN IN *******
1
**********
RS)
5.3.14 TRANSFORMATION VON EXPRESSIONSVEKTOREN IN ULTRAKOMPETENTE
ESCHERICHIA
COLI
BAKTERIEN.................................................................................................................
51
5.3.15 H E RSTE LLUN G O N
LAGERUNGSKULTUREN...........................................................................
52
5.3.16
MUTAGENESE.........................................................................
52
**
5.4 TRANSFEKTION VON HEK293*ZE*EN ZUR STABILEN EXPRESSION DES CAT1
*
5.5 CHARAKTERISIERUNG GENERIERTER
ZE**NEN.................................................................56
5.5.1
MRNA-EXPRESSIONSANALYSE........................................................................................
56
5.5.1.1
RNA-ISOLIERUNG................................................................................................................
56
5.5.1.2 REVERSE TRANSKRIPTION DER MRNA IN CDNA
..................................................................
57
5.5.1.3 QUANTIFIZIERUNG DER CDNA TRANSKRIPTION
......................................................................
58
5.5.2 PROTEINEXPRESSIONSANALYSE
.........................................................................................
59
5.5.2.1
ZELLAUFBEREITUNG.............................................................................................................
59
5.5.2.2 P
*
*
T
*
I
*
G
*
H
**
T
*
B*
*
TIMMU
*
G
............................................................................................
60
5.5.2.3
IMMUNBLOTANALYSE...........................................................................................................
60
5.5.2.4 NACHWEIS VERSCHIEDENER PROTEINE AUF EINEM IMMUNBLOT
............................................
64
5.5.3
IMMUNFLUORESZENZANALYSE...........................................................................................64
5.5.3.1
ZELLAUFBEREITUNG..............................................................................................................
65
5.5.3.2
IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG.............................................................................................65
5.5.3.3
IMMUNFLUORESZENZMIKROSKOPIE......................................................................................66
5.6 FUNKTIONELLER NACHWEIS VON TRANSPORTPR.TEINEN ETABLIERTER ZE**N*EN
MITTELS
AUFNAHMETRANSPORTEXPERIMENTEN..............................................................66
5.7
TRANSPORTEXPERIMENTE..................................................................................................
67
5.7.1
AUFNAHMETRANSPORTEXPERIMENTE................................................................................
68
5.7.1.1
ZELLAUFBEREITUNG.............................................................................................................
68
5.7.1.2 AUFNAHMETRANSPORT-VERFAHREN UNTER VERWENDUNG RADIOAKTIV
MARKIERTER
SUBSTANZEN
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. .
* * *.** * * * *
*************69
5.7.1 *3 QUANTIFIZIERUNG DER ZELLULAEREN AKKUMULATION VON RADIOAKTIV
MARKIERTEM ADMA
*
L-ARGININ
*
METFORMIN UND
***+
......................................................................................72
5.7.2
EXPORTEXPERIMENTE.......................................................................................................72
5.7.2.1
ZELLAUFBEREITUNG.............................................................................................................
73
5_7.22 EXPORTEXPERJMENTE UND QUANTIFIZIERUNG VON [^HJADMA MITTELS
SZINTILLATIONSVERFAHREN....................................................................................................
73
5.7.3 QUANTIFIZIERUNG VON AUSGESTROEMTEN ADMA
*
SDMA UND L-ARGININ IM
EXTRAZELLULAER-KOMPARTIMENT........................................................................................
74
*
.7.3.1
ZELLAUFBEREITUNG.............................................................................................................74
5./.3.2 EXPERIMENTDURCHFUEHRUNG UND
PROBENAUFBEREITUNG.....................................................74
5.7.3.3 QUANTIFIZIERUNG VON ADMA, SDMA UND L-ARGININ MITTELS
LC_MS/MS_ .___._.....__. 75
5.8 STATISTISCHE
ANALYSE...............................................................*
* * 7 7 ************************
6 E R G E B N IS S E
................................................................................................................
79
6.1 UNTERSUCHUNG DESCATI-VERM ITTELTEN TRANSDORTS VON ADMAUND
STRUKTURAEHNLICHEN SUBSTANZEN MITTELS EINER CATIUBEREXPRIMIERENDEN
HEK293 ZELHINIE..................................................................
.
6.1.1 ETABLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG EINER CAT1 UEBEREXPRIMIERENDEN
6.1.2 OPTIMIERUNG DER VERSUCHSBEDINGUNGEN ZUR ANALYSE DES CAT1
VERMITTELTEN
AUFNAHMETRANSPORTS
................................................
81
6.1.3
CHARAKTERISIERUNG DER CATI-VERMITTELTEN ZELLULAEREN AUFNAHME VON ADMA
*
82
..................................................................................
+
N
*
METFORMIN UND ***
*N*
L-A*G
6.1.4
DER CATI-VERMITTELTE AUFNAHMETRANSPORT ALS INTERAKTIONSORT FUER ADMA
,
83
.....................................................................................................
SDMA
UND L-ARGININ
6.1.5
STIMULATION DER CAT1 -VERMITTELTEN ZELLULAEREN ADMA-AUFNAHME DURCH
85
..................................................................................
INTRAZELLULAERES
L-ARGINN
86
.............................................
6.1.6
DER CATI-VERMITTELTE ZELLULAERE EXPORT VON A D M A
ELTEN TRANSPORTS VON
*
VERM
*6.2
UNTERSUCHUNG DES CAT2A- UND CAT2B
UEBEREXPRIMIERENDEN
*
N MITTELS CAT2A- UND CAT2B
*
A*GN
*
ADMA UND L
6.2.1
ETABLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG EINER CAT2A- UND EINER CAT2B
-
87
............................................................
UEBEREXPRIMIERENDEN
HEK293-ZE LINIE
6.2.2
OPTIMIERUNG DER VERSUCHSBEDINGUNGEN ZUR ANALYSE DES CAT2A- UND
89
.................................................................
CAT2B-VERMITTELTENAUFNAHMET*ANSPORTS
6.2.3
CHARAKTERISIERUNG DER CAT2A- UND CAT2B-VERM ITTELTEN ZELLULAEREN
91
...................................................................
AUFNAHME
VON ADMA UND L-ARGININ
6.2.4
STIMULATION DER
P.ATPR-VPRMITTPITPN
ZELLULAEREN ADMA-AUFNAHME DURCH
92
..................................................................................
INTRAZELLULAERES
L-ARGININ
EN TRANSPORTS VON ADMA UND
*E*
6.3
UNTERSUCHUNG DES OCT1-VE*M
93..
.....
*
...
*
..
***
**
OCTIUBEREXPRIMIERENDEN ***293** NE*
*
N MITTELS E
*N*
L-ARG
VERMITTELTEN TRANSPORTS VON ADMA UND
*6.4
UNTERSUCHUNG DES OCT2
94..
............
UBEREXPRIMIERENDEN HEK293*ZELLLINIE
*
N MITTELS EINER OCT2
*N*
L-ARG
6.4.1
FUNKTIONSTEST DER ZELLLINIEN UND OPTIMIERUNG DER VERSUCHSBEDINGUNGEN ZUR
94..
.......*....
....
*
.*...............
ANALYSE DES OCT2-VERMTTELTEN AUFNAHMETRANSPORTS
6.4.2
CHARAKTERISIERUNG DER
*
CT2-VERMITTELTEN ZELLULAEREN AUFNAHME VON ADMA
95
............................................................................................................................
UND
L-ARGININ
6.4.3
VERIFIKATION DER AKTIVEN OCT2-VERMITTELTEN ZELLAUFNAHME BEI HOHEN
97
................................................................
KONZENT*ATIONEN
*
EXTRAZELLULAEREN L-ARGININ
6.5
UNTERSUCHUNG DES MATE1
*
VERMITTELTEN TRANSPORTS VON ADMA UND
98
***
E*N**
UEBEREXPRIMIERENDEN HEK293_ZEL
*
L-ARGININ MITTELS EINER MATE1
100
...............................................................................................................
7
D IS K U S S IO N
7.1
CHARAKTERISIERUNG DES CAT1-VERMITTELTEN TRANSPORTS VON ADMA UND
STRUKTURANALOGEN SUBSTANZEN MITTELS EINER CATLUBEREXPRIMIERENDEN
1
**
..............................................................
HEK293 ZELLLINIE
104
....................................
7.1
*1
ADMA ALS SUBSTRAT UND INHIBITOR DES HUMANEN CAT1
105
..............................................................
7.1.2
DER CAT1 VERM ITTELTE FYPNRT VON A D M A
7.1.3
DER CATI-VERMITTELTE TRANSPORT ALS INTERAKTIONSORT FUER ADMA
*
SDMA UND
106
.........................................................................................................................
L-ARAININ
108
..
............
7.1
*4
KEIN T RANSPOT VON METFCJRMIN UND ***+ DURCH DEN HUMANEN CAT1
VERMITTELTEN TRANSPORTS VON
*7.2
CHARAKTERISIERUNG DES CAT2A_ UND CAT2B
UEBEREXPRIMIERENDEN
*
N MITTELS CAT2A- UND CAT2B
*N*
ADMA UND L_ARG
108
.............................................................
7.2.1
ADMA ALS SUBSTRAT DES HUMANEN C A T 2A
110
.............................................................
7.2.2
ADMA ALS SUBSTRAT DES HUMANEN C A T2B
EN ZELLULAREN ADMA
* -
7.3
STIMULATION
DER CAT1- UND CAT2B-VERMITTE
111
) . .
ARG*NIN
*
AUFNAHME DURCH SUBSTRATE AUF DER TRANS-SEITE (INTRAZELLULAERES
L
VERMITTELTEN TRANSPORTS VON
*
UND OCT2
*7.4
CHARAKTERISIERUNG DES O C T I
ERENDEN
*M*
UEBEREXPR
*
N MITTELS EINER OCT1_ UND OCT2
*N*
A*G
*
ADMA UND L
7.5
CHARAKTERISIERUNG DES * * ** *-VERM*TTELTEN TRANSPORTS VON ADMA UND
114
__.**._
E*N**
ZE*
ERENDEN HEK293
*
L-ARGININ MITTELS EINER MATE1_UEBEREXPRIM
7.6
EINFLUSS ZELLULAERER AUFNAHMEMECHANISMEN AUF DIE NO-SYNTHASE UND DAS
115
.....................................................................................................
*
PARADOX
*N*N*
**
L-ARG
7.7
BEDEUTUNG VON TRANSPORTPROTEINEN FUER DIE HEPATISCHE *IM INATION VON
118
.........................................................................
ARGINN
*
ADM AUND
L
7.8
BEDEUTUNG VON TRANSPORT
^ ^
119
.........................................................................
N*N*
A*G
*
ADM AUND
L
7.9
LOHNENDE TRANSPORTPROTEINE FUER WEITERE UNTERSUCHUNGEN ZUM TRANSPORT
MIT
8
*
T E R A T U R V E R Z
*
CHN*
*
**
___
*
*_*
*
156
.........................................................................................................................................
9
A N H A N G
156
.****
NN-ANALOGA UND ANALYSIERTEN SUBSTRATEN
*9.1
STRUKTURFORMELN VON L-ARG
157
.................................................................................................................................
9.2
VEROEFFENTLICHUNGEN
159
.......................................................................................................................................
10
DA N K S A G U N G
|
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