Die Rolle der löslichen Adenylatzyklase im vaskulären Endothel:
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| Format: | Thesis Microfilm Book |
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| Published: |
Münster
2015
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INHALT
ABKUERZUNGEN I
ABSTRACT V
1 EINLEITUNG 1
1.1 KARDIOVASKULAERE ERKRANKUNGEN UND ARTERIELLE GEFAESSSTEIFIGKEIT 1
1.2 DAS VASKULAERE ENDOTHEL UND DIE GLATTE GEFAESSMUSKULATUR 3
1.2.1 ENDOTHELIALE DYSFUNKTION 6
1.3 DAS RENIN-ANGIOTENSIN-ALDOSTERON SYSTEM (RAAS) 8
1.3.1 ALDOSTERON UND DER MINERALOKORTIKOIDREZEPTOR (MR) 10
1.3.2 DER EPITHELIALE NATRIUMKANAL (ENAC) 12
1.3.3 DIE NA
+
/K
+
-ATPASE 14
1.4 ADENYLATZYKLASEN 16
1.4.1 CAMP ALS SEKUNDAERER BOTENSTOFF 16
1.5 DIE LOESLICHE ADENYLATZYKLASE 18
1.6 ZIEL DER ARBEIT 22
2 MATERIAL 23
2.1 CHEMIKALIEN 23
2.2 SEREN UND MEDIEN 25
2.3 VERBRAUCHSMATERIAL UND KITS 25
2.4 DNA- UND PROTEIN-MARKER 26
2.5 ENZYME UND ANTIBIOTIKA 26
2.6 ANTIKOERPER 27
2.7 PLASMIDE UND VEKTOREN 27
2.8 BAKTERIEN (. COLI) 27
2.9 EUKARYOTISCHE ZELLEN 28
2.10 LABOREQUIPMENT 28
3 METHODEN 30
3.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 30
3.1.1 ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 30
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INHALTSVERZEICHNIS
3.1.1.1 PRAEPARATION GENOMISCHER DNA 30
3.1.1.2 RNA-PRAEPARATION 30
3.1.1.3 RNA-PRAEPARATION AUS VOLLBLUT 30
3.1.1.4 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA IM KLEINEN MASSSTAB (MINI-PRAEPARATION)
30
3.1.1.5 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA IM GROSSEN MASSSTAB (MAXI-PRAEPARATION)
31
3.1.2 PHOTOMETRISCHE BESTIMMUNG DER NUKLEINSAEURE-KONZENTRATION 31
3.1.3 POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR) 31
3.1.3.1 TOUCH DOWN-PCR 32
3.1.3.2 NESTED-PCR 32
3.1.3.3 CDNA-SYNTHESE 33
3.1.3.4 REAL-TIME-PCR 33
3.1.4 DNA/RNA-MODIFIZIERENDE REAKTIONEN 34
3.1.4.1 RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 34
3.1.4.2 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA 34
3.1.4.3 LIGATION 35
3.1.5 AGAROSEGELELEKTROPHORESE 35
3.1.6 AUFREINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN 35
3.1.6.1 GELEXTRAKTION 35
3.1.6.2 DNA-FAELLUNG 36
3.1.6.3 EXO-SAP-AUFREINIGUNG 36
3.1.6.4 PHENOL/CHLOROFORM/ISOAMYLALKOHOL-EXTRAKTION 36
3.1.7 SEQUENZIERUNG 36
3.1.8 CHROMATIN-IMMUNPRAEZIPITATION (CHIP) 37
3.2 PROTEIN-BIOCHEMISCHE METHODEN 38
3.2.1 PRAEPARATION VON ZELLULAEREN PROTEINEXTRAKTEN 38
3.2.1.1 ISOLIERUNG VON KERNPROTEINEN 39
3.2.2 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION 39
3.2.3 WESTERN BLOT MIT SDS-POLYACRYLAMID GEL-ELECTROPHORESE (PAGE) 40
3.3. ZELLBIOLOGISCHE UND MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 41
3.3.1 PROKARYOTISCHE ZELLEN 41
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.1.1 KULTURBEDINGUNGEN 41
3.3.1.2 HERSTELLUNG CHEMISCH-KOMPETENTER E. COLI 41
3.3.1.3 TRANSFORMATION KOMPETENTER E. COLI 42
3.3.2 EUKARYOTISCHE ZELLEN 42
3.3.2.1 KULTURBEDINGUNGEN 42
3.3.2.2 LAGERUNG 43
3.3.2.3 SIRNA-TRANSFEKTION 43
3.3.2.4 TRANSIENTE TRANSFEKTION 43
3.3.2.5 REPORTERGEN-ASSAY 44
3.3.2.6 ATP-ASSAY 44
3.3.2.7 PHALLOIDIN-IMMUNFLUORESZENZFAERBUNGEN 44
3.3.3 FLUORESZENZMESSUNG VON F-AKTIN 44
3.3.4 FLUORESZENZMESSUNG VON INTRAZELLULAEREN CALCIUMKONZENTRATIONEN 45
3.3.4.1 FLUORESZENZ-MESSUNG VON INTRAZELLULAEREN CALCIUMKONZENTRATIONEN
MITTELS
VIDEOMIKROSKOPIE 48
3.4 ATOMIC FORCE MICROSCOPY (AFM) 49
3.5 STUDIENPOPULATION 50
3.6 IN SILICO ANALYSEN ZUR VORHERSAGE PUTATIVER
TRANSKRIPTIONSFAKTORBINDESTELLEN
(TFBS) 50
3.7 STATISTISCHE AUSWERTUNG 50
4 ERGEBNISSE 51
4.1 ZELLULAERE SAC-LOKALISATION IN ENDOTHEL- UND NIERENZELLEN 51
4.2 SAC BEEINFLUSST DIE CREB-PHOSPHORYLIERUNG 52
4.3 SELEKTIVE INHIBIERUNG DER SAC REDUZIERT DIE CRE- UND GRE-VERMITTELTE
TRANSKRIPTIONSAKTIVITAET 54
4.4 SAC-AKTIVITAET BEEINFLUSST DIE EXPRESSION ENDOTHELIALER GENE 56
4.4.1 INHIBIERUNG DER SAC VERHINDERT DIE BINDUNG DES
TRANSKRIPTIONSFAKTORS CREB-P AN
CRE-PROMOTORELEMENTE DES ENAC UND DER NA7K
+
-ATPASE-A 58
4.4.2 INHIBIERUNG DER SAC FUEHRT ZU VERMINDERTER ENAC- UND NA
+
/K
+
-ATPASE-A-
PROTEINEXPRESSION 59
4.4.3 SAC-KNOCKDOWN VERAENDERT DIE EXPRESSION DES ENAC UND DER NA
+
/K
+
-ATPASE 60
INHALTSVERZEICHNIS
4.5 SPIRONOLAKTON BEEINFLUSST DIE ZELLULAERE LOKALISATION DER SAC 62
4.6 NATRIUM-INDUZIERTE NA
+
/K
+
-ATPASE-A/SS-EXPRESSION IM VASKULAEREN ENDOTHEL WIRD
DURCH SAC BEEINFLUSST 63
4.6.1 ERHOEHTE NATRIUMKONZENTRATIONEN VERAENDERN DIE EXPRESSION DER NA
+
/K
+
-ATPASE..63
4.6.2 NATRIUM-ABHAENGIGE ERHOEHUNG DER ATP1A1- UND ATP1B1-EXPRESSION IST
SAC
ABHAENGIG 65
4.6.3 DAS ALTERN ENDOTHELIALER ZELLEN IN VITRO IST MIT EINER
VERMINDERTEN ATP1A1-
EXPRESSION ASSOZIIERT 69
4.7 INHIBIERUNG DER SAC KANN DIE VERSTEIFUNG DER ENDOTHELZELLE
VERHINDERN 72
4.7.1 INHIBIERUNG DER SAC FUEHRT ZU VERAENDERUNGEN DES AKTINZYTOSKELETTS
73
4.8 SELEKTIVE INHIBIERUNG DER SAC VERMINDERT DEN CALCIUMEINSTROM NACH
ATP-
STIMULATION 75
4.8.1 MESSUNG DER INTRAZELLULAEREN CALCIUMKONZENTRATION MITTELS
FLUORESZENZMIKROSKOPIE
76
4.8.2 SELEKTIVE INHIBIERUNG DER SAC VERMINDERT DEN CALCIUMEINSTROM NACH
ATP- UND
ANGII-STIMULATION IN GLATTEN MUSKELZELLEN 77
5 DISKUSSION 81
5.1 DIE SAC REGULIERT DIE EXPRESSION VON ENAC-A UND DER NA
+
/K
+
-ATPASE-A 83
5.1.1 DIE INHIBIERUNG DER SAC FUEHRT ZU EINER VERMINDERTEN
TRANSKRIPTIONSAKTIVITAET VON
CRE- UND GRE-PROMOTORELEMENTEN 85
5.2 DIE ENDOTHELIALE NATRIUM-ABHAENGIGE AKTIVIERUNG DER ATP1A1- UND
ATP1B1-
EXPRESSION WIRD DURCH DIE SAC REGULIERT 89
5.3 DIE SAC BEEINFLUSST DIE ENDOTHELIALE STEIFIGKEIT UND DAS
AKTINZYTOSKELETT 91
5.4 DIE SAC BEEINFLUSST DEN CALCIUMEINSTROM IM GEFAESS 92
5.5 ZUSAMMENFASSUNG 94
6 AUSBLICK 95
7 REFERENZEN 96
8 ANHANG 119
9 KONGRESSBEITRAEGE 123
10 PUBLIKATIONEN 125
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