Einfluss des Corezeptors Repulsive Guidance Molecule B (RGMb) auf den Signalweg der Knochenwachstumsfaktoren: = Influence of the coreceptor Repulsive Guidance Molecule b (RGMb) on the Bone Morphogenetic Protein signaling pathway
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| adam_text | BAYERISCHE JULIUS-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET
WUERZBURG
FAKULTAET FUER BIOLOGIE
EINFLUSS DES COREZEPTORS
REPULSIVE GUIDANCE MOLECULE B
(RGMB)
AUF DEN
SIGNALWEG DER KNOCHENWACHSTUMSFAKTOREN
DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES
NATURWISSENSCHAFTLICHEN DOKTORGRADES
DER JULIUS-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET WUERZBURG
VORGELEGT VON
TINAVERENA HELLMANN
GEBOREN IN ANKUM
WUERZBURG 2013
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INHALTSVERZEICHNIS
I
NHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG 1
SUMMARY 3
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 10
1. EINLEITUNG 13
1.1. DAS MENSCHLICHE SKELETT
- EIN DYNAMISCHES GEWEBE 13
1.2. DIE KNOCHENWACHSTUMSFAKTOREN-AUFBAU UND BIOLOGISCHE FUNKTIONEN 20
1.3. DIE REZEPTOREN DER TRANSFORMING GROWTH FACTOR BETA-SUPERFAMILIE 26
1.4. SIGNALTRANSDUKTION UND REGULATION DER KNOCHENWACHSTUMSFAKTOREN 29
1.5. DIE COREZEPTOREN DER REPULSIVE GUIDANCE MOLECULE-FAMILIE 37
1.6. ZIELE DER ARBEIT 43
2. MATERIAL UND METHODEN 45
2.1. MATERIALIEN 45
2.1.1. CHEMIKALIEN 45
2.1.2. KITS 45
2.1.3. ANTIBIOTIKA 46
2.1.4. ENZYME UND PUFFER 46
2.1.5. ANTIKOERPER 46
2.1.6. WACHSTUMSFAKTOREN UND REZEPTOREKTODOMAENEN 47
2.1.7. LABORGERAETE 47
2.1.8. BAKTERIENSTAEMME 48
2.1.9. KULTURMEDIEN 49
2.1.10. STANDARD-PUFFERLOESUNGEN 49
2.1.11. KONSTRUKTE FUER PROKARYOTISCHE EXPRESSIONEN 51
2.1.12. VEKTOREN FUER EUKARYOTISCHE EXPRESSIONEN 52
2.1.13. OLIGONUKLEOTIDE 52
2.1.14. EUKARYOTISCHE ZELLLINIEN 53
5
INHALTSVERZEICHNIS
2.2. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 54
2.2.1. STERILES ARBEITEN 54
2.2.2. QUANTIFIZIERUNG VON DNA
BZW. RNA 54
2.2.3. POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 54
2.2.4. AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 55
2.2.5. KLONIERUNG DER PCR-FRAGMENTE IN EINEN KLONIERVEKTOR 55
2.2.6. RESTRIKTIONSANALYSE 56
2.2.7. LIGATIONSREAKTION 56
2.2.8. TRANSFORMATION 57
2.2.9. KOLONIE-PCR 58
2.2.10. ANALYTISCHE RESTRIKTIONSANALYSE 59
2.2.11. PLASMID -DNA-ISOLIERUNG 59
2.2.12. KONSTRUKTE FUER DIE PROTEINEXPRESSION IN EUKARYOTISCHEN ZELLEN 59
2.3. EXPRESSION REKOMBINANTER PROTEINE IN
ESCHERICHIA COLI
BAKTERIEN 61
2.4. EXPRESSION REKOMBINANTER PROTEINE IN INSEKTENZELLKULTUR 62
2.4.1. KULTURHALTUNG VON SF9-,
TRIEX*- UND HIGHFIVE*-ZELLEN 62
2.4.2. VITALITAETSFAERBUNG UND ZELLZAHLBESTIMMUNG 63
2.4.3. CO-TRANSFEKTION DER SF-9 ZELLEN MIT
DEM BACVECTOR*-3000 DNA-SYSTEM 63
2.4.4. PLAQUE-ASSAY 64
2.4.5. VIRUSAMPLIFIKATION 65
2.4.6. EXPRESSION REKOMBINANTER PROTEINE IN TRIEX*- ODER HIGHFIVE*-
SUSPENSIONSZELLKULTUREN 66
2.5. PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 67
2.5.1. SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 67
2.5.2. FAERBUNG VON PROTEINGELEN 68
2.5.3. PHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINEN 69
2.5.4. WESTERN BLOT 70
2.6. ISOLIERUNG UND
REINIGUNG VON
REKOMBINANTEN BMP-LIGANDEN AUS
E. COLI
ZELLEN
71
2.7. ISOLIERUNG UND REINIGUNG
VON REKOMBINANTEN BMP-REZEPTOREN AUS
E. COLI
ZELLEN 72
6
INHALTSVERZEICHNIS
2.8. ISOLIERUNG
UND REINIGUNG
VON BMP REZEPTOREN
AUS INSEKTENZELLKULTURUEBERSTAND
(ACTR-II/BMPR-II) 72
2.8.1. METALLAFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 72
2.8.2. UMKEHRPHASE-HOCHLEISTUNGSFLUESSIGKEITSCHROMATOGRAPHIE 73
2.9. ISOLIERUNG UND REINIGUNG VON RGMB
AUS INSEKTENZELLKULTURUEBERSTAND 74
2.9.1. METALLAFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 74
2.9.2. ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE 74
2.9.3. UMKEHRPHASE-HOCHLEISTUNGSFLUESSIGKEITSCHROMATOGRAPHIE 75
2.10. BIOTINYLIERUNG VON PROTEINEN 75
2.11. OBERFLAECHEN-PLASMONRESONANZ ANALYSE 76
2.12. ZIRKULARDICHROISMUS-SPEKTROSKOPIE 78
2.13. MASSENSPEKTROMETRISCHE ANALYSEN 79
2.13.1. ELEKTROSPRAY-IONISATION-(ESI)-
FOURIERTRANSFORMATION-IONEN-ZYKLOTRONRESONANZ-
(FTICR)-MASSENSPEKTROMETRIE 81
2.13.2. MATRIX-ASSISTED LASER DESORPTION/IONIZATION (MALDI)
MASSENSPEKTROMETRIE
81
2.14. PROTEINKRISTALLISATION 81
2.15. METHODEN ZUR BESTIMMUNG DER STOECHIOMETRIE DER KOMPLEXBILDUNG 82
2.15.1. ANALYTISCHE GELFILTRATION 82
2.15.2. AUFTRENNUNG DES PROTEINKOMPLEXES MITTELS UMKEHRPHASE-HPLC 83
2.16. ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 86
2.16.1. KULTIVIERUNG VON EUKARYOTISCHEN ZELLLINIEN 86
2.16.2. ALKALISCHE PHOSPHATASE-NACHWEISVERFAHREN MIT LOESLICHEM RGMB 86
2.16.3. LUCIFERASE-REPORTERGEN-NACHWEISVERFAHREN MIT LOESLICHEM
RGMB 87
2.16.4. LUCIFERASE-REPORTERGEN-NACHWEISVERFAHREN MIT MEMBRANSTAENDIGEM
RGMB 88
2.17. DURCHFLUSSZYTOMETRIE 90
2.18. FLUORESZENZMIKROSKOPISCHE METHODEN 91
2.18.1. BESCHICHTUNG VON DECKGLAESCHEN 91
2.18.2. FAERBUNG DER SNAP- UND CLIP-ENZYMFUSIONSPROTEINE 91
2.18.3. KONFOKALE MIKROSKOPIE 92
7
INHALTSVERZEICHNIS
3. ERGEBNISSE 95
3.1. EXPRESSION
UND REINIGUNG REKOMBINANTER
HUMANER RGMB PROTEINE AUS
INSEKTENZELLKULTUR 95
3.1.1. REKOMBINANTE HERSTELLUNG VON HUMANEM RGMB 95
3.1.2. CHARAKTERISIERUNG DER RGMB-CYSTEIN-DELETIONSMUTANTE RGMB
ANCTS
103
3.2. STRUKTUR- UND FUNKTIONSANALYSEN VON HUMANEM RGMB
PROTEIN 114
3.2.1. SEKUNDAERSTRUKTURANALYSE
UND UNTERSUCHUNG
DER FALTUNGSSTABILITAET
VON
REKOMBINANTEM RGMB 114
3.2.2. INTERAKTIONSANALYSEN VON RGMB
MIT LIGANDEN DER TGF
-SS
SUPERFAMILIE 115
3.2.3. INTERAKTIONEN VON RGMB
MIT MODULATOREN DER TGF
-SS
SUPERFAMILIE 121
3.2.4. INTERAKTIONEN VON RGMB
MIT REZEPTOREN DER TGF
-SS
SUPERFAMILIE 123
3.3. FUNKTIONELLE ANALYSEN DER RGMB SIGNALMECHANISMEN IN
ZELLEN 127
3.3.1. MODULATION DES BMP-SIGNALWEGES
DURCH LOESLICHES RGMB PROTEIN
IN ZELLEN 127
3.3.2. EINFLUSS DER GLYKOSYLIERUNG AUF DIE AKTIVITAET VON RGMB 136
3.3.3. UNTERSCHIEDE IN DER
WIRKUNG VON
MEMBRANSTAENDIGEM UND LOESLICHEM
RGMB AUF DEN
BMP-SIGNALWEG 141
3.4. RGMB ALS
TEIL HOEHERMOLEKULARER SIGNALKOMPLEXE 149
3.4.1. UNTERSUCHUNGEN
ZUR COLOKALISATION
DES RGMB-COREZEPTORS
UND BMP-
REZEPTOREN 149
3.4.2. BILDUNG
DER
BMP-LIGAND/REZEPTOR
KOMPLEXE
IN GEGENWART
DES
BMP COREZEPTORS
RGMB 158
3.4.3. DER COREZEPTOR
RGMB SOWIE
DIE BMP TYP L UND TYP II REZEPTOREN
NUTZEN
UNTERSCHIEDLICHE HAUPTBINDEDETERMINANTEN DES BMP-2
LIGANDEN 172
4. DISKUSSION 175
4.1. DIE BMP-SPEZIFISCHEN COREZEPTOREN DER RGM-FAMILIE 179
4.1.1. RGMB INTERAGIERT
SELEKTIV MIT BMP-,
NICHT ABER MIT
TGF
-SS
LIGANDEN 180
4.2. ANALYSE
DER
ZUGRUNDELIEGENDEN MOLEKULAREN
MECHANISMEN DER
BEEINFLUSSUNG
DES
BMP-
SIGNALWEGES DURCH RGMB 184
4.2.1. RGMB ZEIGT
IN VITRO KEINE DIREKTEN INTERAKTIONEN MIT
DEN EKTODOMAENEN DER BMP TYP
I
UND TYP II REZEPTOREN 184
8
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.2. DIE KOMPLEXBILOUNG VON RGMB MIT BMP-LIGANDEN
INHIBIERT DEREN INTERAKTION MIT
TYP
I REZEPTOREN UND VERMITTELT EINE SELEKTIVITAET GEGENUEBER DER TYP II
REZEPTORWAHL.. 186
4.3. INTERAKTIONSMECHANISMEN
VON RGMB MIT DEM SIGNALWEG DER
KNOCHENWACHSTUMSFAKTOREN 188
4.4. STRUKTURELLE ANALYSEN LIEFERN
HINWEISE AUF MOEGLICHE
MOLEKULARE MECHANISMEN
DER TYP
II
REZEPTORSELEKTIVITAET 195
4.5. AUSBLICK 207
5. LITERATURVERZEICHNIS 209
6. ANHANG 234
6.1. DNA- SOWIE AMINOSAEURESEQUENZEN DER EXPRESSIONSKONSTRUKTE 234
PUBLIKATIONEN 247
DANKSAGUNG 249
EHRENWOERTLICHE ERKLAERUNG 251
9
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| spelling | Hellmann, Tina Verena Verfasser (DE-588)109323945X aut Einfluss des Corezeptors Repulsive Guidance Molecule B (RGMb) auf den Signalweg der Knochenwachstumsfaktoren = Influence of the coreceptor Repulsive Guidance Molecule b (RGMb) on the Bone Morphogenetic Protein signaling pathway vorgelegt von Tina Verena Hellmann, geboren in Ånkum Influence of the coreceptor Repulsive Guidance Molecule b (RGMb) on the Bone Morphogenetic Protein signaling pathway Würzburg 2013 251 Seiten Illustrationen, Diagramme txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Dissertation Julius-Maximilians-Universität Würzburg, Fakultät für Biologie 2013 Mit einer Zusammenfassung in deutscher und englischer Sprache Knochen-Morphogenese-Proteine (DE-588)4305932-6 gnd rswk-swf Transforming Growth Factor (DE-588)4263995-5 gnd rswk-swf Rezeptor (DE-588)4049722-7 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Knochen-Morphogenese-Proteine (DE-588)4305932-6 s Rezeptor (DE-588)4049722-7 s Transforming Growth Factor (DE-588)4263995-5 s DE-604 Erscheint auch als Online-Ausgabe urn:nbn:de:bvb:20-opus-85568 https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85568 Resolving-System kostenfrei Volltext DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=028740878&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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