Charakterisierung von Membranvesikeln enterohämorrhagischer Escherichia coli:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2015
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| Beschreibung: | VII S., [2] Bl., 143 S. Ill., graph. Darst. 30 cm |
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
1 THEORETISCHER HINTERGRUND 1
1.1 HUMANPATHOGENE ESCHERICHIA COLI ^ 1
1.2 ENTEROHAEMORRHAGISCHE ESCHERICHIA COLI 4
1.2.1 SEROTYPEN 5
1.2.2 TRANSMISSION 5
1.2.3 KRANKHEITSVERLAUF UND SYMPTOMATIK 6
1.3 DER AUSBRUCHSSTAMM OL04:H4 7
1.3.1 CHARAKTERISTIKA DES EHEC-SEROTYPS OL04:H4 9
1.4 PATHOGENITAETSFAKTOREN 10
1.4.1 DIE SHIGA TOXINE 10
1.4.1.1 STRUKTURELLER AUFBAU VON SHIGA TOXINEN UND IHREM ZELLULAEREN
REZEPTOR 11
1.4.1.2 WIRKUNGSMECHANISMEN VON SHIGA TOXINEN 13
1.4.2 SHIGA TOXIN-UNABHAENGIGE VIRULENZFAKTOREN 15
1.4.2.1 DAS FLAGELLIN 15
1.4.2.2 DIE SERINPROTEASE-AUTOTRANSPORTERPROTEINE 16
1.4.2.3 DAS EHEC-HAEMOLYSIN 17
1.5 MEMBRANVESIKEL 18
1.5.1 STRUKTUR UND CHEMISCHE ZUSAMMENSETZUNG VON OMVS 19
1.5.2 REGULATION DER OMV-PRODUKTION 21
1.5.3 OMVS ALS TRAEGER VON PATHOGENITAETSFAKTOREN 21
1.6 ZIELZELLLINIEN 22
2 ZIELSETZUNG 25
3 MATERIALIEN UND METHODEN 27
3.1 GERAETE 27
3.2 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 28
3.3 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 28
3.3.1 VERWENDETE BAKTERIENSTAEMME 28
3.3.1.1 WILDTYP-STAEMME 28
3.3.1.2 GENETISCH VERAENDERTE STAEMME 29
3.3.2 KULTIVIERUNG VON BAKTERIEN 29
3.3.2.1 NAEHRBOEDEN UND MEDIEN 30
3.3.2.2 ZELLDICHTEBESTIMMUNG VON BAKTERIENKULTUREN 31
3.3.2.3 ANFERTIGEN EINER WACHSTUMSKURVE 32
3.3.3 ISOLIERUNG VON MEMBRANVESIKELN 32
3.3.3.1 AUFREINIGUNG VON OMVS MITTELS DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION .
33
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INHALTSVERZEICHNIS
3.3.4 ISOLIERUNG VON FLAGELLEN 34
3.3.5 MOLEKULARBIOLOGISCHER NACHWEIS VON DNA IN OMVS 35
3.4 ZELLKULTIVIERUNG 35
3.4.1 VERWENDETE ZELLLINIEN 35
3.4.1.1 HUMANE INTESTINALE EPITHELZELLEN 35
3.4.1.2 HUMANE MIKROVASKULAERE GEHIRN-ENDOTHELZELLEN 36
3.4.1.3 DIE VERO-B4 ZELLLINIE 36
3.4.2 KULTURMEDIEN UND KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN 36
3.4.3 SUBKULTIVIERUNG VON ADHAERENTEN ZELLLINIEN 37
3.4.4 VITALITAETS- UND ZELLDICHTEBESTIMMUNG 38
3.4.5 KRYOKONSERVIERUNG VON EUKARYOTISCHEN ZELLEN 39
3.4.6 AUFTAUEN VON ZELLEN 39
3.5 ZELLBASIERTE UNTERSUCHUNGEN 39
3.5.1 ANALYSE DES ENDOZYTOSEWEGES VON MEMBRANVESIKELN 39
3.5.2 ZYTOTOXIZITAETSTEST IN ANLEHNUNG AN DEN
VERO CELL ASSAY
40
3.5.3 DNA-FRAGMENTIERUNGSASSAY 41
3.5.4 DETEKTION VON INTERLEUKIN-8 42
3.5.5 ISOLIERUNG VON LYSOSOMEN VON HBMECS UND CACO-2 ZELLEN 43
3.5.6 ISOLIERUNG VON MITOCHONDRIEN VON HBMECS UND CACO-2 ZELLEN 44
3.5.7 ADHAERENZASSAY 44
3.6 ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE AUFNAHMEN VON OMVS 45
3.6.1 NEGATIVFAERBUNG 45
3.6.2 KRYO-ELEKTRONENMIKROSKOPIE 46
3.7 PROTEINBIOCHEMISCHE ANALYSEN 47
3.7.1 PROTEINFAELLUNGEN 47
3.7.1.1 TRICHLORESSIGSAEURE-FAELLUNG 47
3.7.1.2 METHANOL-CHLOROFORM-FAELLUNG NACH WESSEL UND FLUEGGE 47
3.7.2 KONZENTRIERUNG VON OMV-FREIEN KULTURUEBERSTAENDEN 47
3.7.3 PROTEINQUANTIFIZIERUNG 48
3.7.4 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 48
3.7.5 IMMUNCHEMISCHE DETEKTION VON PROTEINEN MITTELS
WESTERN-BLOT-ANALYSE 50
3.7.5.1 TRYPTISCHER IN-GEL VERDAU GEFOLGT VON MALDI-TOF-MS 54
4 ERGEBNISSE 57
4.1 MEMBRANVESIKEL DES EHEC-SEROTYPS O104:H4 57
4.1.1 KINETISCHE UNTERSUCHUNGEN 57
4.1.2 BIOCHEMISCHE KOMPOSITION DER MEMBRANVESIKEL 60
4.1.2.1 ALLGEMEINE STRUKTURELLE CHARAKTERISIERUNG 60
4.1.2.2 SPEZIFISCHE PATHOGENITAETSFAKTOREN 61
4.1.2.3 OMV-ASSOZIATION DER DETEKTIERTEN VIRULENZFAKTOREN 64
4.1.2.4 MASSENSPEKTROMETRISCHE ANALYSE VON OMV-ASSOZIIERTEN
VIRULENZFAKTOREN 68
4.1.3 WIRTSZELLINTERAKTION VON OL04:H4 OMVS 69
4.1.4 BIOLOGISCHE EFFEKTE VON OL04:H4 OMVS AUF INTESTINALE
EPITHELZELLLINIEN . 72
4.1.4.1 OMV-ASSOZIIERTE AUFNAHME VON STX2A IN EPITHELZELLLINIEN .... 72
4.1.4.2 ZYTOTOXISCHE EFFEKTE DURCH OMVS 73
4.1.4.3 UNTERSUCHUNG DES OMV-BEDINGTEN ZELLTODES 77
4.1.5 IMMUNMODULATORISCHE EFFEKTE VON OL04:H4 OMVS AUF EPITHELZELLLINIEN
79
INHALTSVERZEICHNIS
4.1.6 EFFEKTE VERSCHIEDENER UMWELTEINFLUESSE AUF O104:H4 0A4VS 84
4.2 DAS OMV-ASSOZIIERTE EHEC-HLY 88
4.3 DIE STACKED-BRICK AGGREGATIVE ADHAERENZ DES EHEC-SEROTYPS OL04:H4 95
5 DISKUSSION UND AUSBLICK 99
5.1 MEMBRANVESIKEL DES EHEC-SEROTYPS OL04:H4 99
5.1.1 STRUKTURELLE CHARAKTERISIERUNG DER OMVS UND IHRER ASSOZIIERTEN
VIRULENZFAKTOREN 99
5.1.2 WIRTSZELLINTERAKTION UND ZELLULAERE SCHAEDIGUNG VON HUMANEN
INTESTINALEN
EPITHELZELLEN DURCH OMVS 102
5.1.3 PROINFLAMMATORISCHES POTENZIAL VON OMV-ASSOZIIERTEM FLAGELLIN 104
5.2 DIE BEDEUTENDE ROLLE DES PAA-PLASMIDS IM AUSBRUCHSSTAMM .... 105
6 ZUSAMMENFASSUNG 109
LITERATURVERZEICHNIS 111
ANHANG 129
A CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 129
B PEPTIDE MASS FINGERPRINT ANALYSE 131
B.L IDENTIFIZIERTES AUSSENMEMBRANPROTEIN A (OMPA) 131
B.2 IDENTIFIZIERTES AUSSENMEMBRANPROTEIN X (OMPX) 132
B.3 IDENTIFIZIERTES AUSSENMEMBRANPROTEIN C (OMPC) 133
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 135
TABELLENVERZEICHNIS 139
ABBILDUNGS VERZEICHNIS 141
LEBENSLAUF 143
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