Patienten-spezifische induziert pluripotente Stammzellen für den zellvermittelten Gentransfer bei metachromatischer Leukodystrophie:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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2015
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 9
1. EINLEITUNG 11
1.1 METACHROMATISCHE LEUKODYSTROPHIE 11
1.2 ENZYMERSATZTHERAPIE UND ZELLVERMITTELTER GENTRANSFER 12
1.3 EMBRYONALE STAMMZELLEN 14
1.4 INDUZIERT PLURIPOTENTE STAMMZELLEN 15
1.5 NEURALE STAMMZELLEN 16
1.6 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 18
2. MATERIAL 19
2.1 ZELLLINIEN 19
2.1.1 IPS-ZELLEN 19
2.1.2 ES-ZELLEN 19
2.1.3 FIBROBLASTEN 19
2.1.4 293-ZELLEN 19
2.2 ZELLKULTUR-REAGENZIEN 20
2.3 ZELLKULTURMEDIEN 21
2.4 PLASTIKWARE FUER DIE ZELLKULTUR 22
2.5 GERAETE 23
2.6 MOLEKULARBIOLOGISCHE KOMPLETTSYSTEME 24
2.7 ENZYME 24
2.8 PRIMER 25
2.9 PLASMIDE 26
2.10 CHEMIKALIEN UND BIOCHEMIKALIEN 27
2.11 MARKER 27
2.12 PUFFER 28
2.13 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 28
2.14 WESTERN BLOT 29
2.15 BAKTERIEN 29
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6
2.15.1 E.COLI-BAKTERIEN (DH5A) 29
2.15.2 NAEHRMEDIEN 29
2.16 IMMUNDEFIZIENTE MAUSSTAEMME 29
2.16.1 SCID/BEIGE- UND RAG-IL-MAEUSE 29
2.17 ANTIKOERPER 30
2.17.1 PRIMAERE ANTIKOERPER 30
2.17.2 SEKUNDAERE ANTIKOERPER 31
2.18 IMMUNFLUORESZENZ-REAGENZIEN 31
2.19 SOFTWARE 31
3. METHODEN 32
3.1 ZELLKULTUR 32
3.1.1 BESCHICHTUNGEN 32
3.1.1.1 BESCHICHTUNG MIT GELATINE 32
3.1.1.2 BESCHICHTUNG MIT POLY-L-ORNITHIN UND LAMININ 32
3.1.2 FIBROBLASTEN 32
3.1.2.1 KULTIVIERUNG VON FIBROBLASTEN 32
3.1.2.2 EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON FIBROBLASTEN 33
3.1.3 ES- UND IPS-ZELLEN 33
3.1.3.1 KULTIVIERUNG VON PLURIPOTENTEN ZELLEN 33
3.1.3.2 EINFRIEREN VON PLURIPOTENTEN ZELLEN 33
3.1.3.3 AUFTAUEN VON PLURIPOTENTEN ZELLEN 34
3.1.3.4 IN VITRO DIFFERENZIERUNG DER IPS-ZELLEN IN DIE DREI KEIMBLAETTER
34
3.1.3.5 GENERIERUNG EINES TERATOMS 34
3.1.4 IT-NES ZELLEN 35
3.1.4.1 DIFFERENZIERUNG VON IPS-ZELLEN IN IT-NES ZELLEN 35
3.1.4.2 KULTIVIERUNG VON IT-NES ZELLEN 36
3.1.4.3 EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON IT-NES ZELLEN 36
3.1.4.4 DIFFERENZIERUNG VON IT-NES ZELLEN IN NEURONE UND GLIAZELLEN 37
3.1.4.5 TRANSPLANTATION MLD-ABGELEITETER NEURALER STAMMZELLEN 37
3.2 MOLEKULARBIOLOGIE 38
3.2.1 EXTRAKTION VON RNA UND HERSTELLUNG VON CDNA 38
3.2.2 PCR 38
7
3.2.3 ANALYSE DER
SINGLE NUCLEOTIDE
POLYMORPHISMS (SNPS) 39
3.2.4 ASA-AKTIVITAETSASSAY 40
3.2.5 HOMOGENISIERUNG VON ZELLEN 40
3.2.6 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 40
3.2.7 WESTERN BLOT 41
3.2.8 KLONIERUNG DER ASA-SEQUENZ IN EIN LENTIVIRALES KONSTRUKT 41
3.2.9 TRANSFORMATION VON KOMPETENTEN .CO//-BAKTERIEN (DH5A) 42
3.2.10 PLASMIDPRAEPARATION 42
3.2.11 DNA-SEQUENZIERUNG 42
3.2.12 LENTIVIRALE TRANSDUKTION 43
3.3 IMMUNFLUORESZENZ UND IMMUNZYTOCHEMIE 43
3.3.1 STANDARDVORGEHEN IMMUNFLUORESZENZ 43
3.3.2 IMMUNFLUORESZENZ TRA-1-60 UND TRA-1-81 44
3.3.3 FAERBUNG AUF ALKALISCHE PHOSPHATASE 44
3.3.4 IMMUNFLUORESZENZ ASA 44
4. ERGEBNISSE 45
4.1 VALIDIERUNG DER MLD-IPS-KLONE 45
4.1.1 MLD-IPS-ZELLEN EXPRIMIEREN PLURIPOTENZMARKER 45
4.1.2 NACHWEIS VON PLURIPOTENZMARKERN AUF RNA-EBENE MITTELS RT-PCR 46
4.1.3 DEAKTIVIERUNG DER RETROVIRALEN TRANSGENE 47
4.1.4 MLD-IPS-ZELLEN ZEIGEN EINEN NORMALEN KARYOTYP 49
4.1.5 IN VITRO DIFFERENZIERUNG VON MLD-IPS-ZELLEN IN DIE DREI
KEIMBLAETTER 51
4.1.6 NACHWEIS VON PLURIPOTENZ
IN VIVO
- BILDUNG EINES TERATOMS 52
4.2 UEBERFUEHRUNG VON MLD-IPS-ZELLEN IN EINE NEURALE STAMMZELLPOPULATION
52
4.3 DIFFERENZIERUNG VON MLD-IT-NES ZELLEN IN NEURONE UND GLIAZELLEN 54
4.4 KONSTRUKTION EINES LENTIVALEN VEKTORS MIT ASA-SEQUENZ UND
GENKORREKTUR... 55
4.5 ASA-EXPRESSION
IN VITRO
NACH LENTIVIRALEM GENTRANSFER 57
4.6 EVALUATION AUF UEBERLEBEN NACH TRANSPLANTATION UND ASA-EXPRESSION
IN VIVO
60
5. DISKUSSION 62
5.1 MLD-SPEZIFISCHE IPS-ZELLEN 62
5.2 TRANSGENE UND REPROGRAMMIERUNG 63
8
5.3 MLD-SPEZIFISCHE NEURALE STAMMZELLEN 64
5.4 DEMYELINISIERUNG, OLIGODENDROZYTEN UND ZELLERSATZ 65
5.5 GENKORREKTUR DER ASA-DEFIZIENZ 65
5.6 ZELLVERMITTELTER GENTRANSFER
IN VIVO
66
5.7 AUSBLICK 68
6. ZUSAMMENFASSUNG 69
7. LITERATURVERZEICHNIS 70
8. DANKSAGUNG 79
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