Evaluierung von PCR-Systemen zum Nachweis von Borrelia burgdorferi sensu lato mit Prävalenzuntersuchungen zum Hauptvektor ixodes ricinus und dessen Borrelia burgdorferi sensu-lato-Infektionsrate entlang eines Höhengradienten in Ostbayern:
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2015
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REFERENZZENTRUM FUER BORRELIEN
AM BAYERISCHEN LANDESAMT FUER
GE
SUNDHEIT UND LEBENSMITTELSICHERHEIT IN
OBERSCHLEISSHEIM
PRAESIDENT: DR. MED.
ANDREAS ZAPF
EVALUIERUNG VON PCR-SYSTEMEN ZUM
NACHWEIS VON BORRELIA BURGDORFERI
SENSU LATO MIT PRAEVALENZUNTERSUCHUNGEN
ZUM HAUPTVEKTOR
IXODES RICINUS UND DESSEN BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO-LNFEKTIONSRATE
ENTLANG
EINES HOEHENGRADIENTEN IN OSTBAYERN
DISSERTATION ZUM ERWERB DES
DOKTORGRADES DER MEDIZIN
AN DER
MEDIZINISCHEN FAKULTAET
DER
LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET ZU MUENCHEN
VORGELEGT VON
JOHANNES JOSEF BRENAUER
AUS SCHONGAU
2015
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS V
ABBILDUNGSVERZEICHNIS VIII
TABELLENVERZEICHNIS IX
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS X
1 EINLEITUNG 1
1.1 GESCHICHTLICHE ENTWICKLUNG DER LYME-BORRELIOSE 2
1.2 BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO
- ERREGER DER LYME-BORRELIOSE 3
1.2.1 KLASSIFIKATION UND MORPHOLOGIE 3
1.2.2 TAXONOMIE UND VERBREITUNG 5
1.3 INFEKTION MIT
LYME-BORRELIOSE 8
1.3.1 VEKTOR (ZECKE) 8
1.3.2 UEBERTRAGUNG UND ENTFERNUNG
DER ZECKE 12
1.4 KLINISCHE MANIFESTATION DER
LYME-BORRELIOSE 13
1.5 DIAGNOSTIK DER LYME-BORRELIOSE 17
1.5.1 ANTIKOERPEMACHWEIS 17
1.5.2 KULTIVIERUNG 18
1.5.3 POLYMERASE-KETTENREAKTION 19
1.6 THERAPIE 20
1.7 PROPHYLAXE 21
2 ZIELSTELLUNG 22
3 MATERIAL UND METHODEN 24
3.1 PROBENMATERIAL : 24
3.1.1 NUECHTERNE FREILANDZECKEN 24
3.1.2 UEBERBLICK DER FANGFLAECHEN 26
3.1.3 B.B.S.L. KONTROLLSTAEMME 29
3.2 DNA-EXTRAKTION 30
3.2.1 AUTOMATISIERTE DNA-EXTRAKTION AUS NUECHTERNEN
ZECKEN 31
3.2.2 MANUELLE DNA-EXTRAKTION 32
3.3 DNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG MITTELS PICOGREEN 33
3.4 DNA-REINHEITS- UND KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
DER SPEZIFITAETSPROBEN
MITTELS NANODROP 34
3.5 BORRELIENDIAGNOSTIK MITTELS POLYMERASE-KETTENREAKTION 35
3.5.1 GRUNDLAGEN 35
3.5.2 KONTAMINATIONSKONTROLLE 36
3.5.3 PRIMER UND SONDEN DER PCR 36
3.5.4 KONVENTIONELLE SEMI-NESTED OSPA-PCR 37
3.5.4.1 AMPLIFIKAT-DETEKTION MITTELS
AGAROSE 38
3.5.4.2 SPEZIESIDENTIFIKATION MITTELS
RESTRIKTIONSFRAGMENTLAENGENPOLYMORPHIS- MUS
(RFLP) 39
3.5.4.3 AMPLIFIKATSEQUENZIERUNG UND SEQUENZANALYSE 41
3.5.5 REAL-TIME PCR 44
3.5.5.1 REAL-TIME OSPD-PCR 46
V
3.5.5.2 REAL-TIME HBB-PCR 49
3.5.5.3 REAL-TIME P41
-PCR 52
3.5.5.4 BORRELIA BURGDORFERI REAL-TIME PCR 53
3.6 SENSITIVITAETSBESTIMMUNG 53
3.6.1 BERECHNUNG VON BORRELIENGENOMKOPIEN 54
3.6.2 VERDUENNUNGSREIHEN 55
3.7 SPEZIFITAETSTESTUNG 55
3.8 EFFIZIENZBERECHNUNG 56
3.9 BESTIMMUNG DER SCHMELZPUNKTE-RANGE
IN DER
HBB-PCR 56
3.10NACHWEIS VON MISCHINFEKTIONEN IN DER HBB-PCR 57
3.11
STATISTISCHE AUSWERTUNG 57
4 ERGEBNISSE 58
4.1 VALIDIERUNG DER PCR-METHODEN 58
4.1.1 NACHWEIS DER SENSITIVITAETSGRENZEN 58
4.1.2 SPEZIFITAETSVERGLEICH 60
4.1.3 EFFIZIENZVERGLEICH 61
4.1.4 SCHMELZPUNKTANALYSE MITTELS HBB-PCR 63
4.1.5 VERGLEICH DER BBB-PCR-SCHMELZPUNKTANALYSE
MIT DER
RFLP-ANALYSE67
4.1.6 KUENSTLICH EINGESTELLTE MISCHINFEKTIONEN
IN DER
HBB-PCR 69
4.1.7 OSPD-CROSSTALKTEST 72
4.2 PRAEVALENZSTUDIE 73
4.2.1 BEPROBUNG AUS DEM JAHR 2010 73
4.2.2 ANZAHL UND ENTWICKLUNGSSTADIEN GEFANGENER ZECKEN 75
4.2.3 BESONDERHEIT DES STANDORTS AN DER ISARMUENDUNG 77
4.2.4 ZECKENAKTIVITAET 78
4.2.4.1 ZECKENAKTIVITAET AM HOEHENGRADIENT 80
4.2.4.2 SAISONALE ZECKENAKTIVITAET 81
4.2.4.3 ZECKENAKTIVITAET IN ABHAENGIGKEIT VON KLIMATISCHEN
GEGEBENHEITEN 84
4.2.5 BORRELIENDURCHSEUCHUNGSRATEN 84
4.2.6 BORRELIEN-SPEZIES IDENTIFIKATION 86
4.2.6.1 SPEZIESPRAEVALENZ IM BW
- UEBERSICHT 86
4.2.6.2 LOKALE SPEZIESPRAEVALENZ IM BW 87
4.2.7 MISCHINFEKTIONEN 89
5 DISKUSSION 90
5.1 VALIDIERUNG DER PCR-METHODEN 90
5.1.1 SENSITIVITAET 91
5.1.2 SPEZIFITAET 94
5.1.3 EFFIZIENZVERGLEICH 96
5.1.4 HBB-RT-PCR 97
5.2 PRAEVALENZSTUDIE 100
5.2.1 ZECKENAKTIVITAET 100
5.2.1.1 AKTIVITAET DER
ENTWICKLUNGSSTADIEN 100
5.2.1.2 EINFLUSS DES MIKROKLIMAS 102
5.2.1.3 SAISONALE AKTIVITAET 103
VI
5.2.1.4 AKTIVITAET AM HOEHENGRADIENT 104
5.2.1.5 EXOGENER EINFLUSS 105
5.2.2 DURCHSCHNITTLICHE INFEKTIONSRATEN 107
5.2.3 BORRELIENSPEZIESVERTEILUNG 112
5.2.4 MISCHINFEKTIONEN 115
6 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 118
7 LITERATURVERZEICHNIS 120
8 ANHANG 138
8.1 ROHDATEN DER OSP^-VERDUENNUNGSREIHEN 138
8.1.1 AUSGEWAEHLTER FILTER: CY 5
(615-670NM) 138
8.1.2 AUSGEWAEHLTER FILTER: FAM
(483-533NM) 153
8.2 ROHDATEN DER BORRELIA
BURGDORFERI RT-PCR VERDUENNUNGSREIHEN 155
8.3 ROHDATEN DER
P41 SENSITIVITAETSERGEBNISSE 162
8.4 ROHDATEN DER HBB
VERDUENNUNGSREIHEN 170
9 DANKSAGUNG 179
10 VEROEFFENTLICHUNGEN 181
11 LEBENSLAUF 182
12 EIDESSSTATTLICHE VERSICHERUNG 183
VII
|
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