Mitochondriale Funktionsstörungen in einem Parkinson-Zellkulturmodell mit Alpha-Synuclein-Überexpression:
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2015
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|---|---|
| adam_text | MIT GENEHMIGUNG DER
MEDIZINISCHEN FAKULTAET
DER UNIVERSITAET MUENCHEN
BERICHTERSTATTER:
PD DR. MED.
ANDREAS BENDER
MITBERICHTERSTATTER:
PROF. DR. MED.
PETER BARTENSTEIN
PROF. DR. MED.
STEFAN LORENZ!
MITBETREUUNG DURCH
DEN
PROMOVIERTEN MITARBEITER:
PH.D. ANDREW KOOB
DEKAN:
PROF. DR. MED.
DR. H.C. M. REISER,
FACR, FRCR
TAG DER MUENDLICHEN PRUEFUNG: 19.03.2015
HTTP://D-NB.INFO/1072082284
INHALTSVERZEICHNIS
1.EINLEITUN G 3
1.1 ERSCHEINUNGSFORMEN DES PARKINSON-SYNDROMS 3
1.2
N
EUROPATHOLOGIE UND
P
ATHOPHYSIOLOGIE DES
P
ARKINSON-
S
YNDROMS 3
1.3 PATHOGENETISCHE ERKLAERUNGSMODEILE 3
1.4 A-SYNUCLEIN 4
1.4.1 STRUKTUR UND PHYSIOLOGISCHE FUNKTION VON A-SYNUDEIN 4
1.4.1.1 STRUKTUR VON A-SYNUCLEIN 4
1.4.1.2 PHYSIOLOGISCHE FUNKTION VON A-SYNUDEIN
5
1.4.2 A-SYNUDEIN UND PARKINSONISMUS 6
1.4.2.1 A-SYNUDEIN UND GENETISCH BEDINGTES PARKINSON-SYNDROM 6
1.4.2.2 A-SYNUDEIN UND LEWY-PATHOLOGIE
7
1.4.2.3 A-SYNUDEIN IN DER PATHOGENESE DES PARKINSON-SYNDROMS 8
1.4.2.3.1
A-SYNUDEIN-AGGREGATION 8
1.4.2.3.2 A-SYNUDEIN IN DER SYNAPTISCHEN DOPAMIN-
UND VESIKELFUNKTION 9
1.5 MITOCHONORIEN UNO
PARKINSON-SYNDROM 10
1.5.1 MITOCHONDRIALE DYSFUNKTION IN DER PATHOGENESE DES
PARKINSON-SYNDROMS 10
1.5.2. DAS ZUSAMMENSPIEL ZWISCHEN MITOCHONDRIEN UND A-SYNUDEIN 12
1.6 DIE
MITOCHONDRIALE DNA (MTDNA) 14
1.6.1 ALLGEMEINE CHARAKTERISTIKA DER MTDNA 14
1.6.2 MTDNA-KOPIENANZAHL 16
1.6.3 DNA-POLYMERASE Y (POLG) 17
2. ZIELSETZUNG 20
3. MATERIAL UND METHODEN 21
3.1
Z
ELLKULTUR 21
3.1.1 GRUNDLAGEN HEK 293-ZELLEN 22
3.1.2 AUFTAUEN UND ANZUCHTEN DER ZELLSTOCKS 23
3.1.3 SPLITTEN DER ZELLEN 23
3.1.4 ZELLZAEHLUNG ... 24
3.1.4.1 GRUNDLAGEN ZELLZAEHLUNG 24
3.1.4.2 DURCHFUHRUNG ZELLZAEHLUNG. 24
3.1.5 PLASMID-TRANSFEKTION DER ZELLEN 25
3.1.5.1
PLASMID-HERSTELLUNG
25
3.1.5.2 PLASMID-TRANSFEKTION 25
3.1.5.2.1
GRUNDLAGEN PLASMID-TRANSFEKTION 25
3.1.5.2.2 DURCHFUEHRUNG
PLASMID-TRANSFEKTION 25
3.1.6 ERNTEN DER ZELLEN 26
3.2 BCA-ASSAY UND
WESTERN BLOT 27
3.2.1 BCA-ASSAY 27
3.2.1.1 GRUNDLOGEN BCA-ASSAY 27
3.2.1.2 DURCHFUEHRUNG BCA-ASSAY 28
3.2.2 WESTERN BLOT 29
3.2.2.1 GRUNDLAGEN WESTEM BLOT 29
3.2.2.2 DURCHFUHRUNG WESTERN BLOT 30
3.3 FLUORESZENZUNTERSUCHUNGEN 32
3.3.1 IMMUNFLUORESZENZ 32
3.3.1.1 GRUNDLAGEN IMMUNFLUORESZENZ 32
3.3.1.2 DURCHFUEHRUNG IMMUNFLUORESZENZ
33
3.3.2 MITOTRACKER* 35
3.3.2.1 GRUNDLAGEN MITOTRACKER* 35
3.3.2.2 DURCHFUHRUNG DER FAERBUNG MIT MITOTRACKER
9
36
3.4 PROTEIN
COMPIEX IMMUNOPRECIPITAHON (CO-)P) 36
3.4.1 GRUNDLAGEN CO-IP 36
3.4.2 DURCHFUHRUNG CO-IP 37
3.5
G
ENEXPRESSIONSANALYSE 39
1
3.5.1 RNA-EXTRAKTION 39
3.5.1.1 GRUNDLAGEN RNA-EXTRAKTION 39
3.5.1.2 DURCHFUEHRUNG RNA-EXTRAKTION 40
3.5.2 CDNA-HERSTELLUNG 41
3.5.2.1 GRUNDLAGEN CDNA-HERSTELLUNG 41
3.5.2.2 DURCHFUEHRUNG CDNA-HERSTELLUNG 41
3.5.3 QRT-PCR
(QUANTITATIVE REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION)
42
3.5.3.2
GRUNDLAGEN QRT-PCR. 42
3.5.3.1.1
SEQUENZSPEZIFISCHER NACHWEIS DURCH
FRET-SONDEN 43
3.5.3.1.2 QUANTIFIZIERUNG
DER SIGNALE 44
3.5.3.2 DURCHFUEHRUNG QRT-PCR 44
3.6 BESTIMMUNG
DER MTDNA
-KOPIENANZAHL
46
3.6.1
DNA-EXTRAKTION 46
3.6.
J.
1 GRUNDLAGEN DNA-EXTRAKTION 46
3.6.1.2 DURCHFUEHRUNG DNA-EXTRAKTION 46
3.6.2 BESTIMMUNG DER MTDNA-KOPIENANZAHL 47
3.6.2.1 GRUNDLAGEN DER BESTIMMUNG DER MTDNA-KOPIENANZAHL 47
3.6.2.2 DURCHFUEHRUNG DER BESTIMMUNG DER MTDNA-KOPIENANZAHL 47
4. ERGEBNISSE 49
4.1 NACHWEIS DER CZ-SYNIICLEIN-UEBEREXPRESSJON 49
4.1.1 NACHWEIS DES TRANSFEKTIONSERFOLGS DURCH WESTERN BLOT 49
4.1.2 NACHWEIS DES TRANSFEKTIONSERFOLGES DURCH IMMUNFLUORESZENZ 50
4.1.3 NACHWEIS DES TRANSFEKTIONSERFOLGES DURCH QRT-PCR 51
4.2 AUSWIRKUNGEN
DER O-SYNUCLEIN-UEBEREXPRESSION 52
4.2.1 ZELLWACHSTUM UND -MORPHOLOGIE UND MITOCHONDRIALES NETZWERK 52
4.2.2 AUSWIRKUNGEN AUF DIE PROTEINLEVEL DER MITOCHONDRIALEN ATMUNGSKETTE
53
4.2.3 AUSWIRKUNGEN AUF DIE MTDNA-KOPIENANZAHL 54
4.2.4 AUSWIRKUNGEN AUF DIE DNA-POLYMERASE Y 56
5. DISKUSSION 59
5.1 ETABLIERUNG DES ZEILKULTURMODELLS 59
5.1.1 AUSWAHL DER ZELLART, DES MOLEKULAREN FAKTORS UND DER
TRANSFEKTIONSMETHODE 59
5.1.2 PRAKTISCHE ERSTELLUNG DES ZELLKULTURMODELLS 60
5.2
DNA-POLYMERASE
Y
UND MTDNA
-KOPIENANZAHL
UNTER O-SYNUCLEIN-UEBEREXPRESSION
62
5.3 ZELLVITAUTAET UND
-
M
ORPHOLOGIE UNTER (I-SYNUCLEIN-EINFLUSS 64
5.4 STRUKTURELLE MITOCHONDRIALE VERAENDERUNGEN
UNTER O-SYNUCLEIN 65
5.5 PROTEINLEVEL DER KOMPLEXE DER
MITOCHONDRIALEN ATMUNGSKETTE UNTER CL-SYNUCLEIN
67
6. ZUSAMMENFASSUNG 69
7. ANHANG 70
7.1
A
BKUERZUNGSVERZEICHNIS 70
7.2 BILDNACHWEIS
INTERNETQUELLEN 72
8. LITERATURVERZEICHNIS 75
9. DANKSAGUNG 85
10. EIDESSTATTLICHE VERSICHERUNG 86
2
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