Untersuchungen zur Funktion eines singulären Nukleotidpolymorphismus im cAMP-abhängigen Promotor I.3/II der Aromatase in Präadipozyten:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
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2015
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| Beschreibung: | 93 Bl. Ill., graph. Darst. 29,5 cm |
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
1. ZUSAMMENFASSUNG 1
2. EINLEITUNG 3
2.1 AROMATASE 4
2.1.1 DIE SYNTHESE VON OESTROGENEN 4
2.1.2 FUNKTIONEN UND WIRKUNGSWEISEN VON OESTROGENEN 5
2.1.3 GEWEBESPEZIFISCHE AROMATASEEXPRESSION UND PROMOTORSYSTEME 5
2.2 AROMATASE IN MAMMAKARZINOMEN 7
2.3 CCAAT/ENHANCER-BINDING PROTEINS (C/EBPS) 8
2.3.1 STRUKTUR 8
2.3.1.1 N-TERMINUS 8
2.3.1.2 C-TERMINUS UND BINDUNG AN GENREGULATORISCHEN ELEMENTEN 8
2.3.2 ISOFORMENENTSTEHUNG UND TRANSLATION BEI DER C/EBP-EXPRESSION 9
2.3.3 C/EBPSS: FUNKTIONEN UND POSTTRANSLATIONALE MODIFIKATIONEN 11
3. ZIEL DER ARBEIT 13
4. METHODEN UND MATERIALIEN 15
4.1 ZELLKULTUR 15
4.1.1 KULTURHERSTELLUNG 15
4.1.1.1 AUFTAUEN KRYOKONSERVIERTER ZELLEN 15
4.1.1.2 SUBKULTIVIERUNG ZELLEN 15
4.1.2 ZELLLINIEN UND MEDIEN 16
4.1.2.1 3T3-L1 PRAEADIPOZYTEN-ZELLLINIE 16
4.1.2.2 HUMANE STROMAZELLEN (PRAEADIPOZYTEN) 17
4.1.2.2.1 ISOLIERUNG VON STROMAZELLEN AUS HUMANEM FETTGEWEBE 17
4.1.2.2.2 KULTIVIERUNG VON STROMAZELLEN AUS HUMANEM FETTGEWEBE 18
4.1.2.3 MEF-ZELLLINIEN 18
4.1.2.4 HEK293-ZELLLINIE 18
4.1.2.5 MCF-7-MAMMAKARZINOMZELLLINIE 19
4.1.2.6 MDA-MB231-MAMMAKARZINOMZELLLINIE 19
4.1.3 HERSTELLUNG VON TUMORZELL-KONDITIONIERTEM MEDIUM 19
I
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INHALTSVERZEICHNIS
4.1.4 ZELLSTIMULATIONEN IM PRAEKONFLUENTEN ZUSTAND 19
4.1.5 FLUORESCEINDIACETAT (FDA)-TEST 20
4.1.6 DIFFERENZIERUNG DER 3T3-L1 PRAEADIPOZYTEN ZU ADIPOZYTEN 21
4.1.7 OIL RED O - FAERBUNG 21
4.2 PRAEPARATION UND ENTSALZUNG LOESLICHER KERNEXTRAKTE 22
4.2.1 PRAEPARATION LOESLICHER KERNEXTRAKTE 22
4.2.2 ENTSALZUNG LOESLICHER KERNEXTRAKTE 22
4.3 PROTEINQUANTIFIZIERUNGEN NACH BRADFORD 23
4.4 ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ASSAY (EMSA) 23
4.4.1 HERSTELLUNG EINES NATIVEN POLYACRYLAMIDGELS 23
4.4.2 HYBRIDISIERUNG DER DNA-OLIGONUKLEOTIDE 24
4.4.3 HERSTELLUNG GELPROBEN 25
4.4.3.1 ALLGEMEINES VORGEHEN 25
4.4.3.2 BESONDERHEITEN ANTIKOERPERINKUBATION 25
4.4.4 ELEKTROPHORETISCHE TRENNUNG UND AUSWERTUNG 26
4.5 KOPPELUNG DER IMMUNPRAEZIPITATION MIT BINDUNG FLUORESZENZMARKIERTER
OLIGONUKLEOTIDE 26
4.5.1 IMMUNPRAEZIPITATION 26
4.5.2 BINDUNG DER FLUORESZENZMARKIERTEN SONDE 26
4.6 IONENAUSTAUSCHERCHROMATOGRAFIE 27
4.6.1 PROBENVORBEREITUNG 27
4.6.2 CHROMATOGRAFIE 27
4.7 TRICHLORESSIGSAEUREFAELLUNG 28
4.8 SDS-PAGE 28
4.8.1 PROBENVORBEREITUNG FUER SDS-PAGE 28
4.8.2 GELHERSTELLUNG UND ELEKTROPHORETISCHE TRENNUNG 29
4.9 RUTHENIUM-F AERBUNG 29
4.10 SOUTHWESTERN BLOT 30
4.11 WESTERN BLOT 30
4.12 MALDI-TOF 31
4.12.1 ISOLATION UND AUFBEREITUNG DER GELSTUECKE 31
4.12.2 WASCHUNG, TRYPSINVERDAU UND EXTRAKTION DER PEPTIDE AUS GELSTUECKEN
31
4.12.3 MALDI-TOF-MESSUNG UND AUSWERTUNG 32
II
INHALTSVERZEICHNIS
4.13 BAKTERIENKULTUR ALLGEMEIN 33
4.13.1 TRANSFORMATION 33
4.13.2 DNA-MINI-PRAEPARATION 33
4.13.3 DNA-MIDI-PRAEPARATION 34
4.14 C/EBPSS-EXPRESSION IN E. COLI UND AUFREINIGUNG 34
4.14.1 C/EBPSS-EXPRESSION 34
4.14.2 C/EBPSS-AUFREINIGUNG 34
4.15 PLASMID-MUTAGENESE 36
4.16 TRANSFEKTION UND LUCIFERASE-REPORTERGENASSAY 38
4.16.1 TRANSFEKTION 38
4.16.2 LUCIFERASE-REPORTERGENASSAY 39
4.17 STATISTISCHE AUSWERTUNGEN 40
5. ERGEBNISSE 41
5.1 UNTERSUCHUNG EINER C/EBPSS-BINDUNG AN DEN SNP-BEREICH IM PROMOTOR
I.3/II DES
AROMATASE-GENS IN ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ASSAYS.* 41
5.1.1 ETABLIERUNG EINES FUER DIE SNP-REGION SPEZIFISCHEN EMSAS 41
5.1.2 FORSKOLIN-UNABHAENGIGE BILDUNG DER PROTEIN-DNA-KOMPLEXE 42
5.1.3 NICHT NACHWEISBARE BETEILIGUNG VON C/EBPSS AM SNP-ABHAENGIGEN
PROTEIN-DNA-
KOMPLEX IM EMSA 43
5.1.4 PHORBOLESTER-UNABHAENGIGE BILDUNG DER PROTEIN-DNA-KOMPLEXE 44
5.1.5 IONENABHAENGIGKEIT DER BILDUNG VON PROTEIN-DNA-KOMPLEXEN 45
5.1.5.1 BEEINFLUSSUNG DER SNP-ABHAENGIGEN PROTEIN-DNA-KOMPLEXBILDUNG
DURCH
NATRIUMCHLORID 45
5.1.5.2 ABHAENGIGKEIT DER PROTEIN-DNA-KOMPLEXBILDUNG VON MAGNESIUM-IONEN
UND
UNABHAENGIGKEIT VON CALCIUM-IONEN 48
5.1.6 KOPPELUNG DER SNP-SPEZIFISCHEN PROTEIN-DNA-KOMPLEXBILDUNG AN DEN
PRAEADIPOZYTAEREN ZUSTAND VON 3T3-L1 ZELLEN 50
5.2 NICHT NACHWEISBARE SNP-SPEZIFISCHE C/EBPSS-DNA-BINDEKOMPLEXE IN
C/EBPSS-
WILDTYP-MEFS IM VERGLEICH ZU C/EBPSS-KNOCK OUT-MEFS 52
5.3 UNABHAENGIGKEIT DER SNP-ABHAENGIGEN PROTEIN-DNA-KOMPLEXE VON
TUMORZELL-
KONDITIONIERTEN MEDIEN 54
5.4 SNP-ABHAENGIGE PROTEIN-DNA-KOMPLEXBILDUNG IN MDA-MB231- UND MCF-7-
MAMMAKARZINOMZELLEN 56
5.5 SNP-SPEZIFISCHE PROTEIN-DNA-KOMPLEXBILDUNGEN IN HUMANEN
PRAEADIPOZYTEN 57
5.6 IDENTIFIZIERUNG EINES SNP-ABHAENGIGEN PROTEIN-DNA-KOMPLEXES 58
III
INHALTSVERZEICHNIS
5.6.1 UNABHAENGIGKEIT DER PROTEIN-DNA-KOMPLEXBILDUNG VON C/EBP8, TFIIB
UND TFIID 58
5.6.2 BINDUNG EINES SNP-SPEZISCHEN 52 KDA-PROTEINS UND EINES
SNP-UNABHAENGIGEN 14 KDA-
PROTEINS AN DIE DNA-SONDE IM SOUTHWESTERN BLOT 59
5.6.3 SNP-UNABHAENGIGE BINDUNG DER SMALL NUCLEAR RIBONUCLEOPROTEINE SMDL,
SMD2 UND
SMD3 AN DIE PUTATIVE C/EBPSS-KONSENSUSBINDESEQUENZ 60
5.6.3.1 AUFTRENNUNG DER 14 KDA- UND 52 KDA-PROTEINE DURCH DIE ANIONEN-
AUSTAUSCHERCHROMATOGRAFIE 60
5.6.3.2 MALDI-TOF: IDENTIFIZIERUNG VON SMDL, SMD2 UND SMD3 61
5.6.3.3 DETEKTION DER SMD-PROTEINE IM WESTERN BLOT UND EMSA 62
5.6.3.4 ZUORDNUNG EINER MINORITAETENFRAKTION VON C/EBPSS IM WESTERN BLOT
ZUR 52 KDA-BANDE
DER SOUTHWESTERN BLOTS 65
5.7 SNP-ABHAENGIGE BINDUNG VON BAKTERIELL EXPRIMIERTEN C/EBPSS AN DIE
SONDE 65
5.8 INHIBITION DER DNA-BINDEFAEHIGKEIT VON C/EBPSS DURCH SUMOYLIERUNG UND
PARYLIERUNG 68
5.9 DNA-BINDUNG VON IMMUNPRAEZIPITIERTEM C/EBPSS 69
5.10 SNP-ABHAENGIGKEIT DER AROMATASE-PROMOTOR I.3/II-AKTIVITAET UNTER
C/EBPSS LAP1
UEBEREXPRESSION IN LUCIFERASE-REPORTERGENASSAYS 70
6. DISKUSSION 72
6.1 DIE ROLLE VON C/EBPSS BEI DER SNP-ABHAENGIGEN
PROTEIN-DNA-KOMPLEXBILDUNG 72
6.1.1 C/EBPSS AUS KERNEXTRAKTEN VON SAEUGERZELLEN SCHEINT NICHT AN
PROTEIN-DNA-
KOMPLEXEN BETEILIGT ZU SEIN 72
6.1.2 ALLE C/EBPSS-ISOFORMEN KOENNEN AN DIE SNP-REGION BINDEN 74
6.1.3 PARYLIERUNG VERHINDERT DIE DNA-BINDUNG VON LAP1 ; 75
6.2 SMALL NUCLEAR RIBONUCLEOPROTEINE (SMD-PROTEINE) ALS NEUE DNA-BINDER
78
6.3 MOEGLICHE PATHOPHYSIOLOGISCHE BEDEUTUNG DES SNPS UND VON C/EBPSS LAP1
BEI
MAMMAKARZINOMEN 80
7. SCHLUSSFOLGERUNG 82
8. LITERATURVERZEICHNIS 83
9. ANHANG 89
9.1 EMSA - UNBESCHNITTENE ORIGINALABBILDUNGEN 89
9.2 LEBENSLAUF 91
9.3 EHRENWOERTLICHE ERKLAERUNG 92
9.4 DANKSAGUNGEN 93
IV
|
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