Zielgerichteter Gentransfer und Zellersatz in Blutgefäßen mit Hilfe magnetischer Nanopartikel:
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Gießen, Lahn
VVB Laufersweiler Verlag
2015
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Titel: Zielgerichteter Gentransfer und Zellersatz in Blutgefäßen mit Hilfe magnetischer Nanopartikel
Autor: Vosen, Sarah
Jahr: 2015
Inhalts-, Abblldungs- und Abkürzungsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung.9 1.1 Das Endothel als funktionelles Organ.9 1.1.1 Stickstoffmonoxid (NO).9 1.1.2 Die endotheliale Stickstoffmonoxid Synthase (eNOS).11 1.1.2.1 Der eNOS-NO-cGMP Signalweg.14 1.1.3 Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF).16 1.2 Atherosklerose - eine Erkrankung des Endothels.18 1.2.1 Therapieoptionen bei Atherosklerose.21 1.2.1.1 Gen- und Zelltherapie als zusätzliche Therapieoption
bei der Behandlung von . Atherosklerose.23 1.3 Magnetische Nanopartikel.25 1.3.1 MNPs in der Gen- und Zelltherapie.28 2 Ziele der Arbeit.30 3 Materialien und Methoden.32 3.1 Verwendete Materialien.32 3.1.1 Geräte.32 3.1.2 Software.33 3.1.3 Verbrauchsmaterialien.33
3.1.4 Chemikalien.34 3.1.5 Puffer und Lösungen.37 3.1.6 Zellkulturmedlen.38 3.1.6.1 Zusammensetzung der Zellkulturmedien.38 3.1.7 Primer.39 3.1.8 Lentivirale Vektoren (LV).39 3.1.8.1 Eingesetzte LV zur Übertragung verschiedener Transgene .39 3.1.8.2 pCHIVeGFP Lentivirus (pCHIV LV).40 3.1.9 Magnetische Nanopartikel (MNPs).40
3.1.10 Antikörper.42 3.1.10.1 Primäre Antikörper für Immunfluoreszenzfärbungen.42 3.1.10.2 Sekundäre Antikörper für Immunfloureszenzfärbungen.42 3.1.10.3 Primäre Antikörper für Western Blot-Experimente.42 3.1.10.4 Sekundäre Antikörper für Western Blot-Experimente.42 3.1.11 Versuchstiere.43 3.2 Ex vivo Perfusionsexperimente.43 3.2.1 Ex vivo Perfusionssystem und Perfusionskammer.43 3.2.1.1 Magnetfeld für ex vivo Perfusionen.44 1
Inhalts-, Abbildungs- und Abkürzungsverzeichnis 3.2.2 Ex vivo Schlauchperfusionen.47 3.2.3 Präparation der Mausaorten für ex vivo Perfusionsexperimente.47 3.2.3.1 Ex vivo Perfusion der Mausaorten.48 3.2.3.1.1 Perfusion mit magnetischen Komplexen.48 3.2.3.1.2 Perfusion mit Zellen.48 3.3 In vivo Zellinjektion.49 3.4 Isometrische Kraftmessungen im Drahtmyographen.54 3.5 Angiogenese-Assay.55 3.5.1 Gewinnung von VEGF-konditioniertem
Medium.56 3.5.2 Bestimmung der VEGF-Konzentration im Medium.56 3.5.3 Aortenring-Aussprossungs-Versuch.57 3.6 Molekularbiologische Methoden.58 3.6.1 Homogenisierung der Aorten.58 3.6.2 RNA-Isolation. . 7 . .58 3.6.3 Reverse Transkription und qRT-PCR.58 3.7 Biochemische Methoden.60 3.7.1 Bestimmung des Eisengehalts der perfundierten Schläuche und Mausaorten .60 3.7.2 Proteinnachweis.60
3.7.3 Proteinisolation und Konzentrationsbestimmung.61 3.7.4 Western Blot.61 3.7.4.1 SDS-PAGE.61 3.7.4.2 Semidry-Blot.61 3.7.4.3 Tankblot.62 3.7.4.4 Immunodetektion.62 3.7.5 Bestimmung der cGMP-Konzentration in den perfundierten Aorten.63 3.8 Immunfluoreszenz- und Preußisch-Blau-Färbung.63 3.8.1 Fixierung mit Paraformaldehyd.64
3.8.2 Kryokonservierung der Aorten.64 3.8.3 Anfertigung von Aortenschnitten.64 3.8.4 Immunfluoreszenzfärbung von Aortenschnitten.64 3.8.5 Preußisch-Blau-Färbung von Aortenschnitten.65 3.9 Mikroskopie.65 3.10 Statistik.65 4 Ergebnisse.67 4.1 Bestimmung der optimalen Magnetkonfiguration zur zielgerichteten direkten . Transduktion und Zellpositionierung in Mausaorten ex vivo .67 4.1.1 Vergleich von Experiment und mathematischer Simulation der. Komplexanlagerung in Blutgefäßen.67 2
Inhalts-, Abbildungs- und Abkürzungsverzeichnis 4.1.2 Radialsymmetrische Transduktion von residentem Endothel in Mausaorten unter Flussbedingungen.69 4.1.3 Radialsymmetrische Positionierung von magnetofizierten Endothelzellen in . Mausaorten unter Flussbedingungen.74 4.2 Zielgerichtete, Magnet-gestützte direkte Transduktion von Endothel in. Mausaorten mit funktionellen Genen.77 4.2.1 Direkte Transduktion von Mausendothel mit magnetischen Komplexen. bestehend aus CMV-eNOS LV und SO-Mag5 MNPs unter Flussbedingungen.77 4.2.1.1 Quantifizierung der eNOS-Expression in eNOS-/- Aorten, die mit CMV-eNOS LV/ . SO-Mag5 Komplexen transduziert wurden.79 4.2.1.2 Analyse
der cGMP-Produktion in eNOS-/- Aorten, die mit CMV-eNOS LV/ SO-. Mag5 Komplexen transduziert wurden.80 4.2.1.3 Einfluss der direkten Transduktion mit CMV-eNOS LV/SO-Mag5 Komplexen auf . die Tonusregulation in eNOS-/- Aorten.81 4.2.2 Direkte Transduktion von Mausendothel mit magnetischen Komplexen. bestehend aus CMV-VEGF LV und SO-Mag5 MNPs unter Flussbedingungen.83 4.2.2.1 Untersuchung der VEGF-Synthese CD1 Aorten nach direkter Transduktion mit. CMV-VEGF LV/SO-Mag5 Komplexen.84 4.3 Zielgerichtete, Magnet-gestützte ex vivo Positionierung von Endothelzellen in . Mausaorten unter Flussbedingungen.86 4.3.1 Zellpositionierung in CD1 Aorten unter Flussbedingungen.87
4.3.1.1 Untersuchung des Einflusses der Deendothelialiserung von CD1 Aorten auf die . Gefäßfunktion.87 4.3.1.2 Radialsymmetrische Positionierung von magnetofizierten, eNOS. überexprimierenden bPAtCs in deendothelialisierten CD1 Aorten.88 4.3.1.3 Quantifizierung der eNOS-Expression in deendothelialisierten CD1 Aorten nach . der Perfusion mit eNOS bPAECs auf mRNA-Ebene.89 4.3.1.4 Analyse des Gefäßtonus in deendothelialisierten CD1 Aorten nach der Perfusion . mit eNOS bPAECs.91 4.3.2 Zellpositionierung in eNOS-/-Aorten unter Flussbedingungen.93 4.3.2.1 Untersuchung des Einflusses der Deendothelialiserung von eNOS-/- Aorten auf . die Gefäßfunktion.93 4.3.2.2 Quantifizierung der eNOS-Expression in deendothelialisierten eNOS-/- Aorten. nach der Perfusion mit eNOS bPAECs.95 4.3.2.3 Analyse der cGMP-Produktion in deendothelialisierten eNOS-/- Aorten nach der . Perfusion mit eNOS bPAECs.96 4.3.2.4 Analyse des Gefäßtonus in deendothelialisierten eNOS-/- Aorten nach der. Perfusion mit eNOS bPAECs.97 3
Inhalts-, Abbildungs- und Abkürzungsverzeichnis 4.4 Zielgerichtete, Magnet-gestützte Positionierung von Endothelzellen in Karotiden . der Maus unter in vivo Flussbedingungen.99 5 Diskussion.104 5.1 Verbesserung von gen- und zelltherapeutischen Ansätzen durch die Verwendung von MNPs in Kombination mit magnetischen Feldern.104 5.1.1 Lokalisierbarkeit.104 5.1.2 Spezifität.106 5.1.3 Effizienz.108 5.2 Sicherheit der Anwendung von Magnet-gestützter Gen- und Zelltherapie.110 5.3 Verbesserung der Behandlungsoptionen bei Gefäßerkrankungen durch. Verwendung von eNOS und VEGF Plasmiden bei der lentiviralen Magnet-. gestützten Gen- und Zelltherapie.114 5.3.1 ENOS.114 5.3.2 VEGF.118 5.4 Fazit und Ausblick.120 6 Zusammenfassung / Abstract.122 7 Literaturverzeichnis.124 4 |
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