Epitop-Kartierung von PBP2A und Identifizierung MRSA-spezifischer immundominanter Peptidsequenzen:
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG
II
INHALTSVERZEICHNIS VI
ABKUERZUNGS- UND SYMBOLVERZEICHNIS X
ABBILDUNGSVERZEICHNIS XIV
TABELLENVERZEICHNIS XVIII
1. EINLEITUNG 1
1.1. DAS IMMUNSYSTEM 1
1.1.1. DIE HUMANE IMMUNANTWORT 1
1.1.2. DIE HUMANE IMMUNABWEHR DURCH ANTIKOERPER 2
1.1.3. DIE SPEZIFISCHE ANTIGENBINDUNG DURCH ANTIKOERPER (EPITOP-PARATOP-
INTERAKTION) 3
1.1.4. KLONALITAET VON ANTIKOERPERN 5
1.2. DAS BAKTERIUM STAPHYLOCOCCUS AUREUS 5
1.2.1. ZELLMORPHOLOGIE UND CHARAKTERISIERUNG 5
1.2.2. HUMANPATHOGENER MIKROORGANISMUS MIT RESISTENZAUSPRAEGUNG:
METHICILLIN-RESISTENTER STAPHYLOCOCCUS AUREUS (MRSA) 7
1.2.3. WIRKMECHANISMUS DER SS-LACTAM-ANTIBIOTIKA AUF PENICILLINBINDE-
PROTEINE 9
1.2.4. DAS PENICILLINBINDE-PROTEIN 2A 10
1.3. KLINISCHE ASPEKTE ANTIBIOTIKA-RESISTENTER MRSA 12
1.4. VERBREITUNG NOSOKOMIALER MRSA-LNFEKTIONEN 12
1.5. MEDIZINISCHE DIAGNOSTIK ZUR SCHNELLEN MRSA-IDENTIFIKATION 14
2. MOTIVATION UND AUFGABENSTELLUNG 17
3. MATERIAL UND METHODEN 21
3.1. EPITOP-KARTIERUNG UND ERSTELLUNG VON PEPTID-BIBLIOTHEKEN AUF
PEPTIDMICROARRAY 23
3.2. CHARAKTERISIERUNG VON HUMANEM SERUM MRSA-INFIZIERTER PATIENTEN 24
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3.2.1. BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION NACH BRADFORD 24
3.2.2. SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE UND COOMASSIE-FAERBUNG 24
3.2.3. WESTERN BLOT 25
3.3. PROZESSIERUNG UND ANALYSE VON PEPTIDBIOCHIPS MIT HUMANEM SERUM 25
3.4. KOMPETITIVER, IMMUNOLOGISCHER ASSAY ZUR UNTERSUCHUNG DER SPEZIFITAET
IDENTIFIZIERTER EPITOPSEQUENZEN 26
3.5. AUSWERTUNG DER PEPTID-MICROARRAY UND IDENTIFIKATION
IMMUNDOMINANTER EPITOPSEQUENZEN 27
3.6. GENERIERUNG IMMUNOGENER PEPTIDSEQUENZEN UND IMMUNISIERUNG 28
3.7. BIOINFORMATISCHE ANALYSE DER ERMITTELTEN ANTIGENDETERMINANTEN 28
3.8. MESSUNG DER AFFINITAET DES MONOKLONALEN C20-ANTIKOERPERS MITTELS
SPR... 29
3.8.1. IMMOBILISIERUNG DER PEPTID-ANALYTE AUF SENSORCHIP 30
3.8.2. VORBEREITUNG DER ANTIKOERPER UND DURCHFUEHRUNG DER SPR-MESSUNGEN 31
3.8.3. BERECHNUNG DER BINDUNGSKONSTANTEN 31
3.9. INDIREKTER ELISA ZUR UNTERSUCHUNG DER ANTIKOERPER-BINDUNG AN
REKOMBINANTES PBP2A 32
3.10. KLASSIFIZIERUNG MRSA-STAEMME, PROBENVORBEREITUNG UND KULTIVIERUNG
VON BAKTERIENSTAEMMEN 32
3.11. ERMITTLUNG DER WACHSTUMSPHASENABHAENGIGEN PROTEINEXPRESSION VON
PBP2A BEI MRSA 34
3.12. INDIREKTER SANDWICH-ELISA MIT NATIVEN BAKTERIEN 35
4. ERGEBNISSE 37
4.1. CHARAKTERISIERUNG VON HUMANEM MRSA-SERUM 37
4.2. PROZESSIERUNG UND SEROLOGISCHE ANALYSEN AUF PEPTID-MICROARRAYS 38
4.2.1. EPITOPKARTIERUNG UND CHIP-DESIGN 38
4.2.2. OPTIMIERUNG DER REAKTIONSBEDINGUNGEN FUER SEROLOGISCHE ASSAYS 39
4.2.3. DATENAUSWERTUNG DER PEPTID-MICROARRAYS UND EPITOP-SELEKTION 42
4.2.4. REPRODUZIERBARKEIT DER GEMESSENEN KONTRASTSIGNALE 45
4.2.5. SPEZIFITAETSNACHWEIS DER IDENTIFIZIERTEN EPITOPSEQUENZEN MITTELS
KOMPETITIVEN ASSAY 47
4.2.6. IDENTIFIZIERUNG IMMUNDOMINANTER SEQUENZEN 49
4.3. BIOINFORMATISCHE ANALYSEN 51
4.3.1. HOMOLOGIE-UNTERSUCHUNG IDENTIFIZIERTER ANTIGENER DETERMINANTEN 51
4.3.2. UNTERSUCHUNG DER PHYSIKO-CHEMISCHEN EIGENSCHAFTEN DER ERMITTELTEN
PBP2A-EPITOPE 54
4.3.3. LOKALISIERUNG DER EPITOPSEQUENZEN IM 3D-MODELL 57
4.4. IMMUNISIERUNG SYNTHETISCHER EPITOPSEQUENZEN UND GENERIERUNG
MONOKLONALER ANTIKOERPER 61
4.5. UNTERSUCHUNG DER BINDUNG DES MONOKLONALEN C20-ANTIKOERPERS AN
PEPTID 17163_2A AUF PEPTID-MICROARRAYS 62
4.6. BESTIMMUNG DER BINDUNGSKINETIK DES MONOKLONALEN C20-ANTIKOERPERS
UEBER OBERFLAECHENPLASMONRESONANZ-MESSUNGEN 64
4.6.1. KINETISCHE BINDUNGSCHARAKTERISIERUNG DES MONOKLONALEN C20-
ANTIKOERPERS AN IMMOBILISIERTE PEPTIDLIGANDEN 64
4.7. UNTERSUCHUNG DER ANTIKOERPERBINDUNG AN REKOMBINANTES PBP2A IM
ELISA 69
4.8. ERMITTLUNG DER PBP2A-PROTEINKONZENTRATION IN ABHAENGIGKEIT DER
WACHSTUMSPHASE VON MRSA 71
4.9. ETABLIERUNG EINES SANDWICH-ELISAS ZUR UNTERSUCHUNG DER
BINDUNGSSPEZIFITAET DES MONOKLONALEN C20-ANTIKOERPERS AN NATIVE
BAKTERIEN 73
4.10. UEBERTRAGUNG UND ANWENDUNG DES GESAMTKONZEPTES ZUR GENERIERUNG
EINES WEITEREN MONOKLONALEN ANTIKOERPERS GERICHTET GEGEN DAS
*IMMUNDOMINANTE ANTIGEN B (ISAB) 78
5. DISKUSSION 87
5.1.1. SEROLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN UND IDENTIFIZIERUNG VON
EPITOPSEQUENZEN.. 87
5.1.2. BIOINFORMATISCHE ANALYSE DER ERMITTELTEN ANTIGENDETERMINANTEN 91
5.1.3. BINDUNGSCHARAKTERISIERUNG DES MONOKLONALEN C20-ANTIKOERPERS 93
5.2. BEDEUTUNG DER ERGEBNISSE FUER DIE PRAKTISCHE ANWENDUNG 97
LITERATURVERZEICHNIS 101
ANHANG 111
DANKSAGUNG 117
EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG 121
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