Etablierung und Validierung eines Verfahrens zum quantitativen Nachweis disseminierter Tumorzellen im Blut von Patientinne mit Zervixkarzinom:
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN 3
ZUSAMMENFASSUNG 5
INHALTSVERZEICHNIS 7
1 EINLEITUNG 9
1.1 DAS ZERVIXKARZINOM 9
1.2 ZERVIXKARZINOGENESE 9
1.3 HUMANE PAPILLOMVIREN (HPV) 12
1.3.1 VIRALE ONKOGENE E6 UND E7 13
1.3.2 HPV-INFEKTIONSZYKLUS 14
1.4 STADIENEINTEILUNG DES ZERVIXKARZINOMS 15
1.5 THERAPIE DES ZERVIXKARZINOMS 15
1.6 TUMORNACHSORGE UND PROGNOSEFAKTOREN BEIM ZERVIXKARZINOM 16
1.7 HAEMATOGENE METASTASEN 18
1.8 METHODEN ZUM NACHWEIS ZIRKULIERENDER TUMORZELLEN 21
1.9 ZIRKULIERENDE TUMORZELLEN ALS PROGNOSEFAKTOREN 23
1.10 ZIELSETZUNG 25
2 MATERIAL UND METHODEN 26
2.1 VERWENDETE MATERIALIEN 26
2.1.1 VERBRAUCHSMATERIALIEN 26
2.1.2 GERAETE 26
2.1.3 REAGENZIEN 27
2.1.4 LOESUNGEN, PUFFER, MEDIEN 28
2.1.5 ENZYME/KITS 31
2.1.6 SONSTIGES 31
2.1.7 ZELLINIEN 32
2.1.8 PRIMER 32
2.2 METHODEN 33
2.2.1 ARBEITEN MIT ZELLKULTUREN 33
2.2.1.1 AUFTAUEN VON ZELLEN AUS FLUESSIGEM STICKSTOFF 33
2.2.1.2 KULTIVIERUNG DER ZELLEN 33
2.2.1.3 EINFRIEREN VON ZELLEN 34
2.2.1.4 ZAEHLEN VON ZELLEN 34
2.2.1.5 HERSTELLEN VON ZELL
VERDUENNUNGEN
34
2.2.2 ANREICHERUNGSMETHODEN FUER KERNHALTIGE ZELLEN AUS DEM BLUT 35
2.2.2.1 FICOLL-DICHTEGRADIENTEN-ZENTRIFIIGATION 35
2.2.2.2 ERYTHROZYTENLYSE (STANDARDPROTOKOLL) 37
2.2.3 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 37
2.2.3.1 REAL-TIME-PCR 38
2.2.3.2 VON DER ONE-STEP ZUR ONE-STEP SEMI-NESTED RT-PCR 39
2.2.3.3 GRADIENTEN-PCR 41
2.2.4 VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG DES HPV-TYPS DES PRIMAERTUMORS 42
2.2.4.1 DNA EXTRAKTION AUS PARAFFIN- UND GEFRIERBLOECKEN 42
7
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INHALTSVERZEICHNIS
2.2.4.2 4-PLEX PCR 43
2.2.4.3 PCR-EIA 44
2.2.5 AGAROSE-GELEKTROPHORESE 44
2.2.6 IMMUNZYTOCHEMIE (IZC) 45
3 ERGEBNISSE 48
3.1 ETABLIERUNG DER IMMUNZYTOCHEMISCHEN FAERBUNG 48
3.2 SENSITIVITAET DES PCR-VERFAHRENS BEI EXTRAHIERTER RNA 49
3.3 ANALYSEN MIT ZELLVERDUENNUNGEN 51
3.3.1 BEDEUTUNG VON DETERGENZIEN 51
3.3.2 UNTERSUCHUNG DES UEBERSTANDES VON ZELLVERDUENNUNGEN 52
3.3.3 UNTERSUCHUNGEN ZUR NACHWEISGRENZE VON HPV-INFIZIERTEN ZELLEN IN
EINER MATRIX VON HPV-
FREIEN C33A ZELLEN 53
3.4 ETABLIERUNG EINES GEEIGNETEN ANREICHERUNGSVERFAHRENS 54
3.4.1 ERYTHROZYTENLYSE 55
3.4.2 FICOLLSEPARATION 56
3.4.2.1 UNTERSUCHUNGEN ZUR EFFEKTIVITAET DER FICOLLANREICHERUNG 57
3.5 SENSITIVITAET DES PCR-VERFAHRENS BEIM NACHWEIS HPV-HALTIGER ZELLEN IN
EINER MATRIX
ANGEREICHERTER MNCS EINER FICOLLSEPARATION 58
3.6 UNTERSUCHUNG DER METHODE AUF ANWENDBARKEIT IM KLINIK- UND
LABORALLTAG 60
3.7 UNTERSUCHUNG VON PATIENTINNEN MIT GEBAERMUTTERHALSKREBS AUF DAS
VORKOMMEN
ZIRKULIERENDER TUMORZELLEN IM EDTA BLUT 61
3.7.1 ERGEBNISSE DER HPV-TYPISIERUNG BEI DEN UNTERSUCHTEN PATIENTINNEN
61
3.7.2 ERGEBNISSE DER ANALYSEN AUF ZIRKULIERENDE TUMORZELLEN IM BLUT 62
3.7.3 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE UND AUSWERTUNG 63
4 DISKUSSION 65
4.1 DIE ERARBEITUNG EINER GEEIGNETEN ANREICHERUNGSMETHODE 65
4.2 SPEZIFITAET UND SENSITIVITAET DES PCR-VERFAHRENS 66
4.3 ZEITLICH BEFRISTETER NACHWEIS GESPIKTER TUMORZELLEN 67
4.4 ERGEBNISAUSWERTUNG DER ZERVIXKARZINOMPATIENTINNEN 68
4.4.1 HPV-TYPISIERUNG IM PRIMAERTUMOR 68
4.4.2 NACHWEIS VON CTCS MITTELS PCR-VERFAHREN 69
4.4.3 NEGATIVER NACHWEIS VON TUMORZELLEN IN DER IZC 71
4.5 DIGITALE-PCR ALS EINE MOEGLICHKEIT ZUR QUANTIFIZIERUNG VON CTCS 72
5 SCHLUSSFOLGERUNG 74
LITERATURVERZEICHNIS 75
ANHANG 85
8
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