Der HPLC-Experte II: So nutze ich meine HPLC/UHPLC optimal!
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Weinheim
Wiley-VCH
2015
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INHALTSVERZEICHNIS
VORWORT XIII
ZUM AUFBAU DES BUCHES XV
BEITRAGSAUTOREN XVII
1 WANN SOLLTE ICH MEINE UHPLC ALS UHPLC BETREIBEN? 1
S. KROMIDAS
1.1 WAS MOECHTE ICH ERREICHEN UND WAS *KANN" DIE UHPLC? 1
1.2 ANFORDERUNGEN AN EINE HPLC-METHODE 3
1.2.1 GUT TRENNEN 3
1.2.2 SCHNELL TRENNEN 13
1.2.3 MASSENEMPFINDLICHKEIT VERBESSERN (KONSTANTES INJEKTIONSVOLUMEN) 15
1.2.4 ROBUSTE TRENNUNGEN GEWAEHRLEISTEN 17
1.3 DIE UHPLC IM ALLTAG 19
1.4 WIE KANN DAS POTENZIAL DER UHPLC TATSAECHLICH AUSGESCHOEPFT
WERDEN? 23
1.5 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 26
LITERATUR 29
TEIL 1 HARDWARE/SOFTWARE SPEZIFIKA, TRENNMODI, MATERIALIEN 31
2 DIE MODERNE HPLC-/UHPLC-ANLAGE 33
2.1 HEUTIGE ANFORDERUNGEN AN DIE EINZELNEN MODULE 33
S. WIESE
2.1.1 UEBERBLICK 33
2.1.2 UHPLC-PUMPENTECHNIK 34
2.1.3 AUTOSAMPIER 41
2.1.4 SAEULENOFEN 47
2.1.5 DETEKTOREN 50
2.1.6 KAPILLAREN/VERSCHRAUBUNGEN 53
LITERATUR 57
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VI | INHALTSVERZEICHNIS
2.2 DER SAEULENOFEN - EINE EINFACHE ANGELEGENHEIT? 59
M. HEIDOM UND F. STEINER
2.2.1 THERMISCHE BETRIEBSWEISEN VON SAEULENOEFEN 62
2.2.2 TEMPERATURUNTERSCHIEDE ZWISCHEN MOBILER PHASE UND LC-SAEULE 64
2.2.3 REIBUNGSWAERME - NUR EIN PHAENOMEN DER UHPLC? 69
2.2.4 THERMOSTATISIERUNG IN DER METHODENUEBERTRAGUNG 76
LITERATUR 79
3 DAS PROBLEM DER EXTERNEN BANDENVERBREITERUNG
IN EINER HPLC-/UHPLC-ANLAGE 81
M. DITTMANN
3.1 THEORETISCHER HINTERGRUND 83
3.1.1 EFFIZIENZ UND PEAKAUFLOESUNG MODERNER UHPLC-SAEULEN 83
3.1.2 BESTIMMUNG DER PEAKVOLUMINA 85
3.2 EXTERNE BANDENVERBREITERUNG IN UHPLC-SYSTEMEN 87
3.2.1 DIE URSACHEN EXTERNER BANDENVERBREITERUNG
IN HPLC-/UHPLC-SYSTEMEN 87
3.2.2 EXPERIMENTELLE BESTIMMUNG DER EXTERNEN BANDENVERBREITERUNG 97
3.3 AUSWIRKUNG EXTERNER BANDENVERBREITERUNG IN VERSCHIEDENEN
APPLIKATIONSBEREICHEN 100
3.3.1 EINFLUSS AUF ISOKRATISCHE TRENNUNGEN 100
3.3.2 AUSWIRKUNGEN AUF GRADIENTENTRENNUNGEN 100
3.4 OPTIMIERUNG DES HPLC-/UHPLC-SYSTEMS 104
3.4.1 TEST DER SAEULENEFFIZIENZ 105
3.4.2 ANDERE ISOKRATISCHE TRENNUNGEN 105
3.4.3 HOCHAUFLOESENDE GRADIENTENTRENNUNGEN 106
3.4.4 SCHNELLE GRADIENTENTRENNUNGEN 106
3.5 ZUSAMMENFASSUNG 107
LITERATUR 108
4 DER GRADIENT - ANFORDERUNGEN, OPTIMALER EINSATZ, TRICKS
UND FALLSTRICKE 111
F. STEINER UND M. HEIDORN
4.1 APPARATIVE EINFLUESSE BEI DER GRADIENTENELUTION - EIN UEBERBLICK 111
4.1.1 GRADIENTENVERWEILVOLUMEN ODER GRADIENTENVERZOEGERUNGS
VOLUMEN 111
4.1.2 ROLLE DES GRADIENTENMISCHERS 113
4.1.3 AUF PHYSIKALISCH-CHEMISCHEN PHAENOMENEN BERUHENDE UNTERSCHIEDE
ZWISCHEN
GRADIENTENPUMPENTYPEN
IIS
4.1.4 APPARATIVE EINFLUESSE AUSSERHALB DER PUMPE 121
4.1.5 BELASTUNG UND ABNUTZUNG VON SAEULEN BEI
GRADIENTENMETHODEN 124
4.2 TECHNISCHE UMSETZUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON GRADIENTEN-
HPLC 125
4.2.1 WISSENSWERTES UND GRUNDLEGENDES ZUM EINFLUSS
DER BEI GRADIENTENPUMPEN ANGEWANDTEN FOERDER
UND DOSIERUNGSTECHNIKEN
126
INHALTSVERZEICHNIS | VII
4.2.2 NOTWENDIGKEIT DER ENTGASUNG DER LAUFMITTELKOMPONENTEN 128
4.2.3 VERSCHIEDENE PUMPENTYPEN (SERIELL, PARALLEL, NOCKENANTRIEB,
SPINDELANTRIEB) UND IHRE SPEZIFIKA 130
4.2.4 AUSWIRKUNGEN DER PUMPENBAUART AUF DIE ANWENDUNG
IM GRADIENTEN 134
4.2.5 AUSWIRKUNGEN DER ARBEITSZYKLEN AUF DIE CHROMATOGRAPHIE
UND NOTWENDIGE ABSTIMMUNGEN BEI HPG-ANLAGEN 135
4.2.6 AUSWIRKUNGEN DER ARBEITSZYKLEN AUF DIE CHROMATOGRAPHIE
UND NOTWENDIGE ABSTIMMUNGEN BEI LPG-ANLAGEN -
EINE GAENZLICH VERSCHIEDENE PROBLEMATIK 139
4.2.7 THERMISCHE EFFEKTE IN EINER GRADIENTENPUMPE
UND IHRE AUSWIRKUNGEN 141
4.2.8 METHODEN MIT BESONDERS STEILEN (BALLISTISCHEN) GRADIENTEN 142
4.2.9 GRUNDSAETZLICHES ZUR BESTIMMUNG DES GRADIENTENVERWEILVOLUMENS
EINER APPARATUR 149
4.2.10 DIE MARKERPULSMETHODE ALS EINE QUICK-AND-DIRTY LOESUNG ISO
4.2.11 DIE DOLAN-METHODE - EIN KLASSIKER UND SEINE VARIANTEN 152
4.2.12 WIE EINE EFFEKTIVE MISCHUNG BEI EINEM ANGEMESSENEN GDV
TECHNISCH ERREICHT WERDEN KANN 154
4.2.13 CHARAKTERISIERUNG DER MISCHUNGSEFFIZIENZ UND GRADIENTENFORMUNG
EINER APPARATUR 160
4.2.14 RICHTIGES MISCHERVOLUMEN IN ABHAENGIGKEIT VON PUMPENTYP,
FLUSSRATE UND APPLIKATION AM BEISPIEL VON TFA-GRADIENTEN
166
4.2.15 GRADIENTENMISCHUNG UND DIE BESONDERHEITEN BEI DER ELUTION
VON PROTEINEN 173
LITERATUR 174
5 ANFORDERUNGEN BEI DER (U)HPLC-KOPPLUNG MIT UNTERSCHIEDLICHEN
MASSENSPEKTROMETERN 175
T. TEUTENBERG, T HETZEL, C. PORTNER UND J. TUERK
5.1 EINLEITUNG 175
5.2 VON DER TARGET-ANALYTIK ZU SCREENINGUNTERSUCHUNGEN 176
5.2.1 TARGET-ANALYTIK 176
5.2.2 SUSPECTED-TARGET SCREENING 176
5.2.3 NON-TARGET SCREENING 177
5.3 WAS IST BEI DER KOPPLUNG VON UHPLC UND MS ZU BEACHTEN? 178
5.3.1 DAS INTERFACE UND DIE OPTIMALE FLUSSRATE 178
5.3.2 OPTIMIERUNG DER MASSENSPEKTROMETRISCHEN PARAMETER 179
5.3.3 OPTIMIERUNG DER CHROMATOGRAPHISCHEN PARAMETER 179
5.3.4 AUSWAHL DER GEEIGNETEN SAEULE UND SAEULENGEOMETRIE 181
5.4 TARGET-ANALYTIK MITTELS TRIPLE-QUADRUPOL-MASSENSPEKTROMETRIE 184
5.5 SCREENING MITTELS LC-MS 192
5.6 MINIATURISIERUNG - LC-MS QUO VADIS? 197
LITERATUR 201
INHALTSVERZEICHNIS
6 2D-CHROMATOGRAPHIE - MOEGLICHKEITEN UND GRENZEN 203
T. TEUTENBERG
6.1 EINFUEHRUNG - WARUM ZWEIDIMENSIONALE HPLC? 203
6.2 PEAKKAPAZITAET EIN- UND ZWEIDIMENSIONALER HPLC-VERFAHREN 205
6.2.1 PEAKKAPAZITAET EINDIMENSIONALER TRENNVERFAHREN 205
6.2.2 PEAKKAPAZITAET ZWEIDIMENSIONALER TRENNVERFAHREN 206
6.3 MODULATION 210
6.3.1 ONLINE HEART-CUT 2D LC 210
6.3.2 UMFASSENDE ONLINE 2D LC 211
6.3.3 STOP-FLOW UND OFFLINE LC
X
LC 213
6.4 PRAKTISCHE PROBLEME DER ONLINE LC
X
LC 214
6.4.1 KOMPATIBILITAET DER LOESEMITTELSYSTEME 214
6.4.2 VERDUENNUNG 214
6.4.3 HOHE FLUSSRATEN 214
6.4.4 KOMPATIBILITAET MIT MASSENSPEKTROMETRIE 215
6.5 REALISIERUNG EINES MINIATURISIERTEN LC
X
LC-SYSTEMAUFBAUS 215
6.5.1 TECHNISCHE PLATTFORM 215
6.5.2 AUSWAHL DER STATIONAEREN PHASEN 216
6.5.3 AUSWAHL DER MOBILEN PHASE UND TEMPERATUR 217
6.5.4 SAEULENGEOMETRIE UND MODULATION 217
6.5.5 GRADIENTENPROGRAMMIERUNG UND GESAMTANALYSENZEIT 218
6.5.6 KOPPLUNG MIT MASSENSPEKTROMETER 218
6.6 APPLIKATIONSBEISPIEL 219
6.6.1 MESSUNG EINES REFERENZSTANDARDS 219
6.6.2 MESSUNG EINER REALPROBE 221
6.7 VORTEILE DER MS/MS-FUNKTIONALITAET 222
6.8 OFFLINE LC
X
LC VERSUS ONLINE LC
X
LC 223
6.9 LOESUNGEN DER GERAETEHERSTELLER (IN ALPHABETISCHER REIHENFOLGE) 226
6.9.1 KOMMERZIELL VERFUEGBARE GESAMTLOESUNGEN FUER DIE LC X LC 227
6.9.2 WEITERE SYSTEMLOESUNGEN 228
6.10 2D-LC - QUO VADIS? 228
6.10.1 SOFTWARE 228
6.10.2 SYSTEMKONFEKTIONIERUNG 229
6.10.3 PEAKKAPAZITAET VERSUS REALPROBE 229
6.11 ABSCHLIESSENDE BEMERKUNGEN 230
LITERATUR 231
7 MATERIALIEN IN HPLC UND UHPLC - WAS FUER WELCHEN ZWECK? 233
TOBIAS FEHRENBACH UND STEFFEN WIESE
7.1 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 233
7.2 UEBERBLICK 234
7.3 ANFORDERUNGEN AN MATERIALIEN EINER UHPLC 235
7.3.1 MECHANISCHE BESTAENDIGKEIT 236
7.3.2 CHEMISCHE BESTAENDIGKEIT 236
7.3.3 KOMPATIBILITAET ZUM ANALYTEN/BIOKOMPATIBILITAET 237
INHALTSVERZEICHNIS IIX
7.4 FLUSSWEGE IN EINEM UHPLC-SYSTEM 238
7.4.1 NIEDERDRUCK-UND HOCHDRUCKFLUSSWEG 238
7.4.2 FLUSSWEG DER MOBILEN PHASE UND DER PROBE 239
7.5 NIEDERDRUCKFLUSSWEG 240
7.6 HOCHDRUCKFLUSSWEG 242
7.6.1 PUMPE 242
7.6.2 AUTOSAMPIER 249
7.6.3 KAPILLAREN UND VERSCHRAUBUNGEN 255
7.7 WANN UND WARUM KANN EIN INERTES UHPLC-SYSTEM ERFORDERLICH
SEIN? 260
7.7.1 BEGRIFF DER INERTHEIT 261
7.7.2 NATUR DER PASSIVSCHICHT 262
7.7.3 ANFORDERUNGEN UND WECHSELWIRKUNGEN 266
7.7.4 PASSIVIERUNGSSTRATEGIEN UND -METHODEN 272
LITERATUR 275
TEIL 2 ERFAHRUNGSBERICHTE, TRENDS 281
8 WAS MUSS
DIE SOFTWARE KOENNEN, DAMIT DIE HARDWARE OPTIMAL GENUTZT
WERDEN KANN? 283
A. SIMON
8.1 EINFUEHRUNG 283
8.2 FUNKTIONALITAET UND BEDIENUNG 284
8.3 INTEGRATION 284
8.4 GERAETESTEUERUNG 285
8.5 BEDIENUNG 286
8.6 EASE OF USE 287
8.7 BEDIENOBERFLAECHEN 288
8.8 MULTILINGUAL 289
8.9 AUSTAUSCH VON DATEN 290
8.10 DATENIMPORT UND -EXPORT 291
8.11 SKALIERBARKEIT VOM PC BIS ZUR GLOBALEN INSTALLATION 292
9 ASPEKTE DER MODERNEN HPLC-ERFAHRUNGSBERICHT EINES ANWENDERS 295
STEFFEN WIESE
9.1 EINFUEHRUNG 295
9.2 BESTIMMUNG DES GRADIENTENVERWEILVOLUMENS 295
9.3 HOCHDURCHSATZTRENNUNG (HIGH THROUGHPUT SEPARATIONS) 299
9.4 METHODENTRANSFER ZWISCHEN UHPLC-SYSTEMEN UNTERSCHIEDLICHER
HERSTELLER 302
9.5 ANWENDUNG HOEHERER TEMPERATUREN 305
9.6 INJEKTION GROSSER VOLUMINA (LARGE VOLUME INJECTION, LVI) 307
9.7 UHPLC-TRENNUNGEN MIT 1 MM INNENDURCHMESSER SAEULEN 312
LITERATUR 315
X | INHALTSVERZEICHNIS
10 ERFAHRUNGSBERICHT EINES UNABHAENGIGEN SERVICEINGENIEURS - TIPPS
UND EMPFEHLUNGEN FUER EINEN OPTIMALEN BETRIEB VON AGILENT- UND
WATERS-ANLAGEN IM ALLTAG 317
S. CHROUSTOVSKY
10.1 EINLEITUNG 317
10.2 DER DEGASSER, PRINZIPIEN 317
10.2.1 VERSCHIEDENE HERSTELLER, VERSCHIEDENE TYPEN 318
10.3 DIE PUMPE, PRINZIPIEN 319
10.3.1 VERSCHIEDENE HERSTELLER, VERSCHIEDENE TYPEN 321
10.4 AUTOSAMPIER, PRINZIPIEN 322
10.4.1 VERSCHIEDENE HERSTELLER, VERSCHIEDENE TYPEN 324
10.5 DIE UV-DETEKTOREN, PRINZIPIEN 325
10.5.1 VERSCHIEDENE HERSTELLER, VERSCHIEDENE TYPEN 326
11 DER ANALYT, DIE FRAGESTELLUNG UND DIE UHPLC -
DER EINSATZ VON UHPLC IN DER PRAXIS 329
S. LAMOTTE
11.1 EINLEITUNG 329
11.2 WANN IST DER EINSATZ VON UHPLC SINNVOLL UND WANN EHER NICHT? 329
11.3 FREISETZUNGSTESTS IN DER PHARMAZEUTISCHEN INDUSTRIE 331
11.4 METHODENENTWICKLUNG UND
-OPTIMIERUNG
331
11.5 KLASSISCHE FLUESSIGCHROMATOGRAPHISCHE ANALYTIK 332
11.6 SCHNELLE (MEIST ZWEITE) DIMENSION DER MULTIDIMENSIONALEN
CHROMATOGRAPHIE 332
11.7 TRENNUNG VON (BIO)POLYMEREN 333
11.8 PROZESSANALYSENTECHNIK (PAT) 334
LITERATUR 334
12 GERAETEHERSTELLER BERICHTEN 335
12.1 AGILENT TECHNOLOGIES, WALDBRONN 335
J. TRAFKOWSKI
LITERATUR 345
12.2 SHIMADZU, DUISBURG 346
B.-T. ERXLEBEN
12.3 THERMO FISHER SCIENTIFIC, GERMERING 352
F. STEINER
12.3.1 ANFORDERUNGEN AN DAS GESAMTE SYSTEM UND WIE DIE ERFAHRUNG
GELEHRT HAT DIESE ZU MEISTERN 352
12.3.2 DIE ELUENTENFOERDERUNGSEINHEIT, WEIT MEHR ALS
EINE HOCHDRUCKPUMPE 357
12.3.3 DER PROBENGEBER FUER DAS ROBUSTE AUSFUEHREN ULTRAPRAEZISER ANALYSEN,
AUCH IM HOCHDURCHSATZ 358
12.3.4 NEUE WEGE DER SAEULENTHERMOSTATISIERUNG FUER DIE BESTE
TRENNLEISTUNG
UND METHODENUEBERTRAGBARKEIT 360
INHALTSVERZEICHNIS | XI
12.3.5 AUCH EINE EXZELLENTE ULTRASCHNELLE TRENNUNG MUSS VON EINEM
DETEKTOR AUFGEZEICHNET WERDEN 361
12.3.6 2D-LC ZUR STEIGERUNG DER PEAKKAPAZITAET UND ANDERE WEGE ZU
DIESEM ZIEL SOWIE ZUR STEIGERUNG DER PRODUKTIVITAET 364
UEBER DIE AUTOREN 367
INDEX 371 |
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