Untersuchungen zur Rolle von bakteriellen und Wirtszell-Faktoren für die Injektion von Yersinia outer proteins in Wirtszellen durch Yersinia enterocolitica:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
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2014
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| adam_text | UNTERSUCHUNGEN ZUR ROLLE VON BAKTERIELLEN UND
WIRTSZELL-FAKTOREN FUER DIE INJEKTION VON
YERSINIA OUTER PROTEINS IN WIRTSZELLEN
DURCH YERSINIA ENTEROCOLITICA
DISSERTATION
DER MATHEMATISCH-NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET
DER EBERHARD KARLS UNIVERSITAET TUEBINGEN
ZUR ERLANGUNG DES GRADES EINES
DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN
(DR. RER. NAT.)
VORGELEGT VON
DIPL.-BIOL. BIRGIT KELLER
AUS REUTLINGEN
TUEBINGEN
2014
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 YERSINIA ENTEROCOLITICA 1
1.1.1 PHYLOGENETISCHE HINORDNUNG 1
1.1.2 VERBREITUNG . _1
1.1.3 KRANKHEITSBILD 2
1.1.4 PATHOGENESE 2
1.1.4.1 AUFRAHME UND INVASION ___2
1.1.4.2 DISSEMINATION UND ABSZESSBILDUNG 3
1.1.5 ADHAESINE 3
1.1.5.1 INVASIN (INV) 4
1.1.5.2 YERSINIA ADHAESIN A (YADA) _7
1.1.5.3 ATTACHMENT INVASION LOCUS (AIL) 10
1.1.5.4 MUCOID YERSINIA FACTOR (MYF)/ PH6-ANTIPEN 12
1.1.6 DAS TYP DI SEKRETIONSSYSTEM 13
1.1.6.1 DAS YSC-INJEKTISOM 13
1.1.6.2 DIE YOP-TRANSLOKATOREN 14
1.1.6.3 YERSINIA OUTER PROTEINS (YOPS) 15
1.1.6.4 REGULIERUNG DES T3SS _1 7
1.1.7 REPORTERSYSTEME ZUR DETEKTION DER YOP INJEKTION 18
1.1.7.1 DER EINSATZ VERSCHIEDENER FUSIONSPROTEINE 18
1.1.7.2 DER EINSATZ EINES SS-LACTAMASE REPORTERSYSTEMS 19
1.2 INTEGRINE 20
1.2.1 INTEGRIN-STRUKTUR UND LIGANDENBINDUNG 21
1.2.2 INTEGRIN-VERMITTELTE SIGNALPROZESSE 23
1.2.2.1 * INSIDE-OUT-SIGNALING 24
1.2.2.2 *OUTSIDE-IN-SIGNALING 25
1.2.3 INTEGRINE ALS REZEPTOREN FUER PATHOGENE MIKROORGANISMEN 26
1.3 FRAGESTELLUNG . 27
2 MATERIAL UND METHODEN .30
2.1 MATERIALIEN _30
2.1.1 GERAETE 30
2.1.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN 31
2.1.3 CHEMIKALIEN 32
2.1.4 REAGENZIEN , 34
INHALTSVERZEICHNIS
2.1.5 FORMULIERUNGEN FIIR DIE ZELL- UND BAKTERIENKULTUR 35
2.1.6 ANTIBIOTIKA 36
2.1.7 SOFTWARE 36
2.2 ARBEITEN MIT BAKTERIEN 37
2.2.1 VERWENDETE BAKTERIENSTAEMME 37
2.2.2 KULTIVIERUNG VON BAKTERIEN 37
2.2.3 GEFRIERKULTUREN 38
2.2.4 SPEKTROMETRISCHE KEIMZAHLBESTIMMUNG 38
2.2.5 TRANSFORMATION VON PLASMID-DNA IN BAKTERIEN 38
2.2.5.1 TRANSFORMATION IN CHEMISCH KOMPETENTE E. COLI 38
2.2.5.2 TRANSFORMATION IN ELEKTROKOMPETENTE YE E40 STAEMME 38
2.3 ARBEITEN MIT EUKARYOTISCHEN ZELLEN 39
2.3.1 ALLGEMEINE ZELLKULTURBEDINGUNGEN 39
2.3.1.1 ABLOESEN VON ZELLEN 39
2.3.1.2 BESTIMMUNG DER LEBENDZELLZAHL MIT TRYPANBLAU 39
2.3.1.3 KRYOKONSERVIERUNG VON ZELLEN 39
2.3.2 VERWENDETE ZELLLINIEN (BEREITGESTELLT! 40
2.3.3 GENERIERUNG TRANSGENER ZELLLINIEN 41
2.3.3.1 STABILE TRANSFEKTION VON GD25 ZELLEN MIT SS6 INTEGRIN 41
2.3.3.2 STABILE TRANSFEKTION VON GE11 ZELLEN MIT SSL INTEGRIN 41
2.3.3.3 GENERIERUNG EINER SSL INTEGRIN MUTANTE MIT TYR ZU ALA
SUBSTITUTION
IN DEN NPXY-MOTIVEN 41
2.3.3.4 GENERIERUNG VON TALIN-1-DEFIZIENTEN NIERENFIBROBLASTEN 42
2.3.3.5 INTERFERENZ MIT PYK2 EXPRESSION IN FAK
J
* ZELLEN DURCH SHRNA 42
2.3.3.6 INTERFERENZ MIT AV INTEGRIN EXPRESSION IN GD25 UND CD ZELLEN
DURCH SHRNA 42
2.3.4 GENERIERUNG VON EINZELKLONEN 43
2.3.5 ANALYSE VON ZELLEN MITTELS DURCHFLUSSZYTOMETRIE 44
2.3.5.1 ANTIKOERPERLABELING VON ZELLEN 44
2.3.6 BLOCKIERUNG VON ZELLULAEREN MECHANISMEN DURCH SPEZIFISCHE
INHIBITOREN 45
2.3.6.1 TOXINE 46
2.3.6.2 PEPTIDE 46
2.3.6.3 WEITERE SUBSTANZEN 46
2.3.7 ANALYSE DER ADHAESION AN ECM PROTEINE 47
2.4 INFEKTIONSVERSUCHE 4 7
2.4.1 INFEKTION VON ZELLEN MIT BAKTERIEN 47
INHAL TS VERZEICHNIS
2.4.2 EINSATZ EINES SS-LACTAMASE REPORTER SYSTEMS ZUR DETEKTION DER YOP
INJEKTION 47
2.4.2.1 DETEKTION DER SS-LACTAMASE AKTIVITAET MITTELS DURCHFLUSSZYTOMETRIE
48
2.4.2.1 DETEKTION DER SS-LACTAMASE AKTIVITAET MITTELS
FLUORESZENZMIKROSKOPIE 49
2.4.3 DETEKTION DER ADHAESION .49
2.4.3.1 DETEKTION DER ADHAESION MITTELS DURTHLICHTMIKROSKOPIE 49
2.4.3.2 DETEKTION DER ADHAESION MITTELS ELEKTRONENMIKIOSKOPIE 49
2.5 GENTRANSFER MIT HILFE VIRALER VEKTOREN _50
2.5.1 GENTRANSFER MIT REKOMBINANTEN RETROVIREN 50
2.5.1.1 TRANSFEKTION VON HEK293T ZELLEN MIT FUGENE 51
2.5.1.2 TRANSFEKTION VON ! NX ZELLEN MITTELS
CALCIUM-PHOSPHAT-PRAEZIPITATION 51
2.5.2 STILLIEGUNG VON GENEN DURCH RNA-INTERFERENZ 52
2.5.2.1 TRANSDUKTION VON SHRNA MIT LENTIVIRALEN PARTIKELN 53
2.5.3 GEN-KNOCKOUT MIT DEM CRE/LOXP-SYSTEM 53
2.5.3.1 TRANSDUKTION VON CRE-REKOMBINASE MIT REKOMBINANTEN ADENOVIREN 54
2.6 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 55
2.6.1 PROTEINAUFREINIGUNG AUS ZELLEN .55
2.6.2 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION NACH BRADFORD 55
2.6.3 DISKONTINUIERLICHE NATRIUMDODECYLSULFAT
POLYACIYLAMID-GELELEKTROPHORESE 56
2.6.4 WESTERN BLOT _57
2.6.5 IMMUNDETEKTION 57
2.6.5.1 IMMUNDETEKTION MIT HRP KATALYSIERTER CHEMILUMINESZENZREAKTION 58
2.6.5.2 IMMUNDETEKTION MIT FLUORESZENZMAIKIERTEN ANTIKOERPERN 58
2.7 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 59
2.7.1 GEWINNUNG VON NUKLEINSAEUREN _59
2.7.1.1 RNA-ISOLIERUNG 59
2.7.1.2 REVERSE TRANSKRIPTION 59
2.7.1.3 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA _59
2.7.1.4 PHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN 60
2.7.2 POLYMERASE KETTENREAKTION (PCR) 60
2.7.2.1 PCR MIT PHUSION HOT START II POLYMERASE 60
2.7.2.2 QUANTITATIVE REAL TIME-PCR MIT FLUORESZENZMARKIERTEN
TAQMAN-SONDEN 61
2.7.3 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 63
2.7.3.1 DURCHFUEHRUNG EINER AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 63
2.7.3.2 DNA-EXTRAKTION AUS AGAROSEGELEN 63
2.7.4 DNA-VERDAU MIT RESTRIKRIONSENDONUKLEASEN 64
INHALTSVERZEICHNIS
2.7.5 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 64
2.7.5.1 VERKNUEPFUNG VON DNA-FRAGMENTEN MIT GLATTEN ENDEN 66
2.7.5.2 VERKNUEPFUNG VON DNA-FRAGMENTEN MIT UEBERHANGENDEN ENDEN 67
2.7.6 GATEWAY REKOMBINATIONSREAKTION 67
2.8 STATISTISCHE ANALYSE 68
3 ERGEBNISSE 69
3.1 DIE BEDEUTUNG VON SSL INTEGRIN EXPRESSION AUF WIRTSZELLEN FUER LNV-
BZW. YADA-VEIMITTELTE YOP
INJEKTION 69
3.1.1 EINE INTERAKTION ZWISCHEN LNV BZW. YADA UND SSL INTEGRINEN IST
VORAUSSETZUNG FUER YOP
INJEKTION IN FIBROBLASTEN 70
3.1.2 YADA-VERMITTELTE YOP INJEKTION IN EPITHELZELLEN IST UNABHAENGIG VON
SSL INTEGRIN EXPRESSION 72
3.1.3 DIE EFFIZIENZ DER INV-VERMITTELTEN YOP INJEKTION IST MIT DEM
AUSMASS DER SSL INTEGRIN
EXPRESSION AUF WIRTSZELLEN ASSOZIIERT 74
3.1.4 YADA-VERMITTELTE ADHAESION AN WIRTSZELLEN IST NICHT ZWANGSLAEUFIG
MIT NACHFOLGENDER YOP
INJEKTION ASSOZIIERT 75
3.2 CHARAKTERISIERUNG DER SSL-UNABHAENGIGEN INTERAKTION VON YADA MIT
WIRTSZELLEN 77
3.2.1 HEPARIN INHIBIERT DIE SSL-ABHAENGIGE SOWIE SSL-UNABHAENGIGE
YADA-VERMITTELTE YOP INJEKTION 77
3.2.2 FN UND VN KOENNTEN ALS ZWISCHENGLIEDER FUER EINE INDIREKTE
YADA-VERMITTELTE INTERAKTION
MIT FIBROBLASTEN UND EPITHELZELLEN DIENEN 78
3.2.3 RGD-PEPTIDE INHIBIEREN DIE SSL-ABHAENGIGE SOWIE SSL-UNABHAENGIGE
YADA-VERMITTELTE YOP
INJEKTION 81
3.2.4 YADA-VERMITTELTE ADHAESION UND YOP INJEKTION KANN UEBER SSL UND AV
INTEGRINE AUS DER
GRUPPE DER RGD-BINDENDEN INTEGRINE ERFOLGEN 82
3.2.5 DIE QUALITAET DER YADA-VERMITTELTEN ADHAESION ENTSCHEIDET UEBER
NACHFOLGENDE YOP INJEKTION 86
3.3 DIE BEDEUTUNG VON SSL BZW. AV INTEGRIN-VERMITTELTEN SIGNALPROZESSEN
FUER DIE YOP INJEKTION 89
3.3.1 DIE CYTOPLASMATISCHE DOMAENE DER SSL INTEGRINE IST FUER LNV- NICHT
JEDOCH FUER YADA-
VERMITTELTE YOP INJEKTION ESSENTIELL 89
3.3.2 DIE NPXY-MOTIVE DER CYTOPLASMATISCHEN DOMAENE VON SSL INTEGRINEN
TRAGEN NICHT
WESENTLICH ZUR YOP INJEKTION BEI 92
3.3.3 DAS ADAPTORPROTEIN TALIN-1 IST NICHT ESSENTIELL FUER DIE YOP
INJEKTION 93
3.3.4 DAS AKTINCYTOSKELETT IST ESSENTIELL FUER LNV- NICHT JEDOCH FUER
YADA-VERMITTELTE YOP INJEKTION 95
3.3.5 ILK, FAK UND C-SRC KINASEN SIND NICHT ESSENTIELL FUER DIE YOP
INJEKTION 96
3.3.5.1 DIE SERIN-/THREONINKINASE ILK IST NICHT ESSENTIELL FUER DIE YOP
INJEKTION
IN FIBROBLASTEN 97
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.S.2 DIE PROTEINTYROSINKINASE FAK IST NICHT ESSENTIELL FUER DIE YOP
INJEKTION
IN FIBROBLASTEN 97
3.3.5.2 C-SRC TYROSINKINASEN SIND NICHT ESSENTIELL FUER DIE YOP INJEKTION
IN FIBROBLASTEN 98
3.3.6 RHO GTPASEN SIND ESSENTIELL FUER INV- UND YADA-VEIMITTELTE YOP
INJEKTION 99
4 DISKUSSION 101
4.1 SSL INTEGRINE SIND NUR FUER INV- NICHT JEDOCH FUER YADA-VERMITTELTE
ADHAESION UND YOP INJEKTION
ESSENTIELL 101
4.2 YADA-VEIMITTELTE ADHAESION UND YOP INJEKTION KANN UEBER SSL UND AV
INTEGRINE AUS DER GRUPPE
DER RGD-BINDENDEN INTEGRINE ERFOLGEN 103
4.3 DIE QUALITAET DER ADHAESION ENTSCHEIDET UEBER NACHFOLGENDE YOP
INJEKTION 105
4.4 DIE BEDEUTUNG VON INTEGRIN-VENNITTELTEN SIGNALPROZESSEN FUER INV-
BZW. YADA-VERMITTELTE
ADHAESION UND YOP INJEKTION 107
4.4.1 DIE BEDEUTUNG VON INTEGRIN-VERMITTELTEM * IMIDE-OUT-SIGNATING FUER
DIE YOP INJEKTION 108
4.4.2 DIE BEDEUTUNG VON INTEGRIN-VEIMITTELTEM * OUTSIDE-IN-SIGNALING
FUER DIE YOP INJEKTION 110
4.5 RESULTIERENDES MODELL FIIR INV- BZW. YADA-VEIMITTELTE ADHAESION UND
YOP INJEKTION 113
5 ZUSAMMENFASSUNG 117
6 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 119
7 LITERATURVERZEICHNIS 125
8 PUBLIKATIONEN 144
9 DANKSAGUNG 145
10 LEBENSLAUF 146
11 EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG 147
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