Frontalhirnschnittkultur als In-vitro-Modell für adulte Neurogenese:
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| adam_text | AUS DEM INSTITUT FUER ANATOMIE UND ZELLBIOLOGIE
ABTEILUNG NEUROANATOMIE
DER ALBERT-LUDWIGS-UNIVERSITAET FREIBURG IM BREISGAU
FRONTALHIRNSCHNITTKULTUR ALS IN V/VRA-MODELL
FUER ADULTE NEUROGENESE
INAUGURAL DISSERTATION
ZUR ERLANGUNG DES MEDIZINISCHEN DOKTORGRADES
DER MEDIZINISCHEN FAKULTAET DER ALBERT-LUDWIGS-UNIVERSITAET
FREIBURG IM BREISGAU
VORGELEGT 2014 VON
ANNA FRANZISKA ZITZMANN
GEBOREN IN AALEN
HUR BESCHRAENK
DEN ANSTAUST*
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1 NEUROGENESE 1
1.1.1 STAMMZELLEN 2
1.1.1.1 BEGRIFF DER STAMMZELLE IM ALLGEMEINEN 2
1.1.1.2 NEURONALE STAMMZELLEN 2
1.1.2 HISTORISCHER UEBERBLICK 3
1.1.3 GERMINATIVE ZONEN IM ADULTEN GEHIRN 5
1.1.3.1 HIPPOCAMPUS... : 6
1.1.3.2 SUBVENTRIKULARZONE 6
1.1.4 MIGRATION ENTLANG DES ROSTRALEN MIGRATORISCHEN STROMS 12
1.1.5 DIFFERENZIERUNG DER ZELLEN IM BULBUS OLFACTORIUS 15
1.1.6 FUNKTION DER ADULTEN NEUROGENESE 16
1.1.7 HUMANE ADULTE NEUROGENESE 17
1.2 UNTERSUCHUNG DER ADULTEN NEUROGENESE 18
1.2.1 DETEKTIONSMETHODEN DER NEUROGENESE IN VIVO 18
1.2.2 DETEKTIONSMETHODEN DER NEUROGENESE IN VITRO .-. 20
1.2.2.1 ORGANOTYPISCHE SCHNITTKULTUREN 20
1.2.3 IN DER VORLIEGENDEN ARBEIT GENUTZTE MARKER FUER NEUROGENESE 22
1.2.3.1 GFAP UND NESTIN, MARKER FIIR STAMMZELLEN 23
1.2.3.2 KI67, EIN MARKER FIIR PROLIFERIERENDE ZELLEN 24
1.2.3.3 DCX, EIN MARKER FUER MIGRIERENDE NEURONE 24
1.2.3.4 NEUN UND CALBINDIN, MARKER FUER DIFFERENZIERTE NEURONE 25
2. FRAGESTELLUNG DER ARBEIT 27
3. MATERIALIEN UND METHODEN 28
3.1 MATERIALIEN 28
3.1.1 VERSUCHSTIERE 28
3.1.2 CHEMIKALIEN 28
3.1.3 PRIMAERANTIKOERPER 30
3.1.4 SEKUNDAERANTIKOERPER 30
3.1.5 SONSTIGE MATERIALIEN 31
3.1.6 VERWENDETE GERAETE 31
3.1.7 VERWENDETE SOFTWARE 32
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.8 LOESUNGSANSAETZE 33
3.1.8.1 KULTURMEDIEN 33
3.1.8.2 FIXATIONSLOESUNGEN 34
3.1.8.3 EINBETTMEDIUM FUER KRYOSTATSCHNITTE 34
3.1.8.4 PUFFERLOESUNGEN 34
3.1.8.5 GELATINE-LOESUNG 35
3.2 METHODEN 35
3.2.1 DIE PRAEPARATION ORGANOTYPISCHER SCHNITTKULTUREN DES FRONTALHIRNS
35
3.2.2 KULTURBEDINGUNGEN 39
3.2.3 KULTURMEDIUM 39
3.2.4 TRANSPLANTATION VON AKTIN-GFP-SPHAEREN .* 39
3.2.5 BRDU-APPLIKATION 40
3.2.6 INFEKTION MIT GFP-LENTIVIREN 40
3.2.7 FIXATION 41
3.2.8 HISTOLOGISCHE AUFARBEITUNG 41
3.2.8.1 GEWEBESCHNITTE 41
3.2.8.2 KRESYLVIOLETTFAERBUNG (NISSL-FAERBUNG) 42
3.2.8.3 DAPI-FAERBUNG 43
3.2.8.4 DNA-DENATURIERUNG 43
3.2.8.5 IMMUNHISTOCHEMIE 43
3.2.9 MIKROSKOPISCHE VERFAHREN 46
3.2.10 LIVE-CELL-IMAGING 46
3.2.10.1 APPLIKATION VON DIL 46
3.2.10.2 VORBEREITUNG DER KULTUREN 47
3.2.10.3 BEDINGUNGEN 48
3.2.10.4 AUFNAHMEPARAMETER 48
3.2.10.5 DATEN- UND BILDVERARBEITUNG 49
3.2.10.6 ANALYSE 49
4. ERGEBNISSE 51
4.1 KULTURBEDINGUNGEN FUER DIE FRONTALHIRNSCHNITTKULTUR IM MODELLTIER DER
RATTE 51
4.2 DER ERHALT DER ORGANOTYPIE UEBER EINEN KULTURZEITRAUM VON 14 TAGEN 52
4.2.1 UEBERSICHTSBILDER NACH DAPI-FAERBUNGEN 53
4.2.2 DARSTELLUNG DER STRUKTUR MITTELS KRESYLVIOLETTFAERBUNG
(NISSL-FAERBUNG) 54
4.3 IMMUNHISTOCHEMISCHE EXPRESSIONSMUSTER DER FRONTALHIRNKULTUREN UEBER
EINEN KULTURZEITRAUM VON 14
TAGEN 56
INHALTSVERZEICHNIS
4.3.1 IMMUNHISTOCHEMISCHER NACHWEIS VON GLIAZELLEN MITTELS GFAP 56
4.3.2 IMMUNHISTOCHEMISCHER NACHWEIS DES INTERMEDIAERFILAMENTS NESTIN 59
4.3.3 NACHWEIS PROLIFERIERENDER ZELLEN MITTELS IMMUNHISTOCHEMIE FUER KI67
63
4.3.4 NACHWEIS PROLIFERIERENDER ZELLEN MITTELS IMMUNHISTOCHEMIE FUER BRDU
65
4.3.5 NACHWEIS MIGRIERENDER NEUROBLASTEN MITTELS IMMUNHISTOCHEMIE FUER
DOUBLECORTIN 67
4.3.6 NACHWEIS AUSDIFFERENZIERTER NEURONE DURCH IMMUNHISTOCHEMIE FUER
NEUN 70
4.3.7 NACHWEIS SPEZIFISCHER NEURONE DURCH IMMUNHISTOCHEMIE FUER CALBINDIN
72
4.4 FUNKTIONELLE EVALUATION DER FRONTALHIRNSCHNITTKULTUREN 75
4.4.1 TRANSPLANTATION VON MAUS-GFP-NEUROSPHAEREN 76
4.4.2 MARKIERUNG MIT DIL 82
* 4.4.3 LIVE-CELL-IMAGING NACH FLUORESZENZMARKIERUNG MIT DIL 85
4.5 INFEKTION MIT GFP-LENTIVIREN 89
5. DISKUSSION 93
5.1 TECHNISCHE EVALUATION DER SAGITTALEN FRONTALHIRNSCHNITTKULTUREN 94
5.2 KRESYLVIOLETT- UND DAPI-FAERBUNG ZEIGEN HINWEISE AUF DEGENERATION DER
FRONTALHIRNSCHNITTKULTUREN IN
ABHAENGIGKEIT VOM KULTURMEDIUM 95
5.3 SPEZIFISCHE MARKER ZEIGEN EINEN ERHALT DER ORGANOTYPIE DER
SAGITTALEN FRONTALHIRNSCHNITTKULTUREN UEBER
EINEN KULTURZEITRAUM VON 14 TAGEN 98
5.4 ALTERATIONEN IM IMMUNHISTOCHEMISCHEN EXPRESSIONSMUSTER VON
ASTROZYTEN ERGEBEN HINWEISE AUF
REAKTIVE ASTROGLIOSE UND BESCHLEUNIGTE REIFUNG IN
FRONTALHIRNSCHNITTKULTUREN 100
5.5 DIE FRONTALHIRNSCHNITTKULTUREN STELLEN ZUM ZEITPUNKT P3-P4 EINE
SCHNITTMENGE ZWISCHEN EMBRYONALER
UND ADULTER NEUROGENESE DAR UND BILDEN DIE PHYSIOLOGISCHE REIFLING DES
GEWEBES AB 104
5.6 VERSCHIEDENE METHODISCHE HERANGEHENSWEISEN ZEIGEN EIN
UNTERSCHIEDLICHES BILD DER MIGRATION IN
FRONTALHIRNSCHNITTKULTUREN 106
5.7 GFP-LENTIVIRUS ZEIGT BEI BESCHRIEBENER METHODIK EINEN TROPISMUS FUER
GLIAZELLEN 111
5.8 AUSBLICK 114
6. ZUSAMMENFASSUNG 116
7. LITERATURVERZEICHNIS 117
8. ANHANG 132
8.1 LEBENSLAUF 132
8.2 DANKSAGUNG 133
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