Die Tyrosinphosphatase SHP-1 reguliert Hypoxie-induzierte endotheliale Proliferation über den HIF-1/VEGF Signalweg:
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MEDIZINISCHEN KLINIK UND POLIKLINIK IV, ABTEILUNG KARDIOLOGIE DER
LUDWIG-MAXIMILIANS-
UNIVERSITAET MUENCHEN
DIREKTOR: PROF. DR. MED. M. REINCKE
UND DEM
WALTER-BRENDEL-ZENTRUM FUER EXPERIMENTELLE MEDIZIN DER UNIVERSITAET
MUENCHEN
VORSTAND: PROF. DR. MED. U. POHL
DIE TYROSINPHOSPHATASE
SHP-1
REGULIERT
HYPOXIE-INDUZIERTE ENDOTHELIALE PROLIFERATION
UEBER DEN HIF-1/VEGF
SIGNALWEG
DISSERTATION
ZUM ERWERB DES DOKTORGRADES DER MEDIZIN
AN DER MEDIZINISCHEN FAKULTAET DER
LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET ZU MUENCHEN
VORGELEGT VON
STEFAN KARL CHRISTIAN ALIG
AUS ASCHAFFENBURG
2014
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INHALTSVERZEICHNIS
I. EINLEITUNG 1
T.L ENDOTHEL UND
HYPOXIE 1
1.1.1 ALLGEMEINE FUNKTION DES
ENDOTHEL 1
1.1.2 SAUERSTOFF UND ANGIOGENESE 1
I.I.B NOTWENDIGKEIT DER ZELLULAEREN ADAPTION
AN HYPOXIE 2
1.2 DER TRANSKRIPTIONSFAKTOR
HIF-1 2
1.2.1 STABILISIERUNG VON
HIF-LA DURCH HYPOXIE 2
1.2.2 ZIELGENE UND
FUNKTION VON
HIF-1 6
1.3 DIE TYROSINPHOSPHATASE SHP-1 6
1.3.1 STRUKTUR, REGULATION
UND FUNKTION VON
SHP-1 7
1.3.2 DIE ROLLE VON
SHP-1
IN ENDOTHELZELLEN 9
II. FRAGESTELLUNG 11
III. MATERIAL UND METHODEN 12
111.1 CHEMIKALIEN, MOLEKULARBIOLOGISCHE REAGENZIEN, GERAETE
UND ANDERE
MATERIALIEN 12
111.1.1 CHEMIKALIEN UND
MOLEKULARBIOLOGISCHE REAGENZIEN 12
111.1.2 GERAETE UND ANDERWEITIGES MATERIAL 12
111.2
ZELLKULTUR 12
111.2.1 KULTIVIEREN VON
HUMANEN MIKROVASKULAEREN
ENDOTHELZELLEN 14
111.2.2 ISOLIERUNG UND
KULTIVIERUNG VON
ENDOTHELZELLEN AUS
HUMANEN
UMBILIKALVENEN 14
111.2.3 PASSAGIEREN VON ZELLEN 15
111.2.4 EINFRIEREN VON ZELLEN 15
111.3
HYPOXISCHE BEDINGUNGEN 15
111.3.1 ERZEUGUNG VON
HYPOXISCHEN BEDINGUNGEN 15
111.3.2 MESSUNG DES SAUERSTOFFGEHALTS IM
ZELLMEDIUM 16
111.3.3 BEHANDLUNG VON ENDOTHELZELLEN MIT
DIVERSEN INHIBITOREN 16
111.4
MOLEKULARBIOLOGIE 17
111.4.1 ANTISENSE-OLIGONUKLEOTID TRANSFER 17
*11.4.2 RNA-EXTRAKTE FUER PCR 18
111.4.3 QUANTITATIVE REAL-TIME PCR 18
111.5
PROTEINCHEMIE 19
111.5.1 ZELLEXTRAKTE FUER WESTERN
BLOT ANALYSE UND
IMMUNPRAEZIPITATION 19
111.5.2 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION 20
III
111.6
IMMUNOLOGISCHE METHODEN 21
111.6.1 WESTERN BLOT ANALYSE 21
111.6.2 IMMUNFLUORESZENZ 24
111.6.3 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 25
111.6.4 IMMUNPRAEZIPITATION 27
111.6.5 ELISA ZUR VEGF-BESTIMMUNG IM
ZELLUEBERSTAND 28
111.7
FUNKTIONELLE ASSAYS 28
111.7.1 ZELL-PROLIFERATIONSASSAY 28
111.7.2 RADIKALMESSUNGEN 29
111.8
STATISTISCHE AUSWERTUNG 31
IV. ERGEBNISSE 32
IV.L ETABLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG
VON HYPOXISCHEN
BEDINGUNGEN IN VITRO 32
IV.1.1
MESSUNG DES
SAUERSTOFFGEHALTS IM ZELLMEDIUM 32
IV.1.2 HYPOXIE INDUZIERT HIF-LA-EXPRESSION 32
IV.1.3 VEGF-PRODUKTION 33
IV.2 POSTTRANSKRIPTIONELLES SILENCING
VON SHP-1
IN ENDOTHELZELLEN 34
IV.3 ROLLE VON SHP-1
BEI HYPOXIE 35
IV.3.1
ZELLULAERE LOKALISATION VON
SHP-1
IN HYPOXIE
UND NORMOXIE 35
IV.3.2 HYPOXIE ERNIEDRIGT
SHP-1
EXPRESSION 36
IV.3.3 SHP-1
KNOCKDOWN ERHOEHT
PROLIFERATION UND VEGF-PRODUKTION WAEHREND
HYPOXIE 37
IV.3.4 SHP-1
ABHAENGIGE PROLIFERATION
UND VEGF-PRODUKTION WAEHREND
HYPOXIE IST HIF-LA
ABHAENGIG 40
IV.4 EINFLUSS VON
SHP-1
AUF HIF-LA WAEHREND HYPOXIE 42
IV.4.1
SHP-1
KNOCKDOWN ERHOEHT
HIF-LA SPIEGEL WAEHREND
HYPOXIE 42
IV.4.2 SHP-1
REGULIERT DIE TRANSKRIPTION VON
HIF-LA NICHT 43
IV.4.3 SHP-1
KNOCKDOWN BEEINFLUSST
HIF-LA VORWIEGEND AUF EBENE DES ABBAUS 44
IV.5 SHP-1 REGULIERT
ENDOTHELIALE SUPEROXIDPRODUKTION WAEHREND HYPOXIE 46
IV.5.1
MESSUNG EXTRAZELLULAERER
SUPEROXIDE 46
IV.5.2 MESSUNG
INTRAZELLULAERER SUPEROXIDE 48
V. DISKUSSION 50
V.L BEDEUTUNG VON
SHP-1
BEI ISCHAEMISCHEN
KRANKHEITSBILDERN 50
V.2 HYPOXISCHE BEDINGUNGEN IN DER ZELLKULTUR 50
V.3 SHP-1
REGULIERT PROLIFERATION UND VEGF-BILDUNG
IN HYPOXIE 51
V.4 SHP-1
REGULIERT VEGF-BILDUNG UEBER
DEN TRANSKRIPTIONSFAKTOR HIF-1 53
IV
V.4.1 PHARMAKOLOGISCHE HEMMUNG VON
HIF-1
INHIBIERT DURCH SHP-1
SIIENCING INDUZIERTE
PROLIFERATION UND VEGF-BILDUNG 53
V.4.2 SHP-1
SIIENCING FUEHRT ZUR
INDUKTION VON HIF-LA 54
V.5 SHP-1
REGULIERT STABILITAET VON HIF-LA 55
V.6 SHP-1
HEMMT DIE BILDUNG REAKTIVER SAUERSTOFFSPEZIES
AUCH WAEHREND HYPOXIE 56
V.7 KLINISCHE BEDEUTUNG DER
HIF-1
REGULATION 59
V.7.1 ISCHAEMISCHE KRANKHEITSBILDER 59
V.7.2 TUMORWACHSTUM UND
METASTASIERUNG 60
VI. ZUSAMMENFASSUNG 62
VII.
ANHANG 65
VLL.L LITERATURVERZEICHNIS 65
VII.2
VERWENDETE ABKUERZUNGEN 75
VII.3
ABBILDUNGSVERZEICHNIS 77
VII.4TABELLENVERZEICHNI5 . ...78
VII.5
VERZEICHNIS VERWENDETER
MATERIALIEN UND GERAETE 79
VII.6
PUBLIKATIONSLISTE 81
VII.7
DANKSAGUNG 82
V
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