Experimentelle und theoretische Untersuchungen zur Modifizierung der Substratspezifität einer Amin-Pyruvat-Aminotransferase:
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 DIE OPTIMIERUNG VON ENZYMEN 2
1.2 DIE BEDEUTUNG VON AMINOTRANSFERASEN IN DER BIOTECHNOLOGIE 4
1.3 DIE STRUKTUR DER ASPARTAT-AMINOTRANSFERASE 7
1.4 DER MECHANISMUS DER TRANSAMINIERUNG 10
1.4.1 DIE REAKTION DES AMINOGRUPPENTRANSFERS 10
1.4.2 DIE BINDUNG DES SUBSTRATS 16
2 ZIELSTELLUNG DER ARBEIT 25
3 MATERIAL 27
3.1 GERAETE 27
3.2 SAEULEN. KITS UND VERBRAUCHSMATERIALIEN 29
3.3 CHEMIKALIEN 29
3.4 MEDIEN 32
3.5 ENZYME 32
3.6 BAKTERIENSTAEMME UND VEKTOREN 33
3.7 MOLEKULARGEWICHTSSTANDARDS 34
3.8 OLIGONUKLEOTIDE 35
3.9 SOFTWARE 36
4 METHODEN 37
4.1 THEORETISCHE METHODEN 37
4.1.1 PSI-BLAST 44
4.1.2 MULTIPLES SEQUENZALIGNMENT 45
4.1.3 KOMPARATIVE MODELLIERUNG 45
4.1.4 IDENTIFIZIERUNG VON SUBSTRAT-BINDENDEN RESTEN .... 46
4.1.5 MOLEKULARES DOCKING 47
4.1.6 MOLEKUELDYNAMIKSIMULATIONEN 49
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VI INHALTSVERZEICHNIS
4.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 51
4.2.1 POLYMERASE-KETTENREAKTION 52
4.2.1.1 KOLONIE-PCR 52
4.2.1.2 SAETTIGUNGSMUTAGENESE 53
4.2.1.3 ORTSGERICHTETE MUTAGENESE 55
4.2.2 REINIGUNG UND ANALYSE VON NUKLEINSAEUREN 56
4.2.2.1 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE UND ETHIDIUM-
BROMID-FAERBUNG 56
4.2.2.2 REINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN 57
4.2.2.3 ISOLIERUNG VON DNA AUS AGAROSE-GELEN . . 58
4.2.2.4 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA 58
4.2.2.5 ETHANOLFAELLUNG 59
4.2.2.6 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA-LOE
SUNGEN 59
4.2.3 KLONIERUNG 60
4.2.3.1 RESTRIKTIONSSPALTUNG VON DNA 60
4.2.3.2 LIGATION VON DNA 61
4.2.4 SEQUENZIERUNG VON DNA 62
4.3 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 62
4.3.1 KULTIVIERUNG UND LAGERUNG VON E. COLI 62
4.3.2 HERSTELLUNG REKOMBINANTER E. COLI STAEMME DURCH
ELEKTROPORATION 63
4.3.3 REKOMBINANTE PROTEINEXPRESSION 64
4.3.3.1 EXPRESSION IM EINZELANSATZ 64
4.3.3.2 EXPRESSION IM PARALLELANSATZ 65
4.3.4 ZELLAUFSCHLUSS 65
4.3.4.1 ZELLAUFSCHLUSS UNTER VERWENDUNG VON DE-
TERGENZIEN 66
4.3.4.2 ZELLAUFSCHLUSS MIT HILFE VON DRUCK 66
4.4 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 67
4.4.1 PROTEINREINIGUNG 67
4.4.1.1 AMMONIUMSULFATFAELLUNG 67
4.4.1.2 ANIONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE 68
4.4.2 PROTEINANALYTIK 69
4.4.2.1 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE ... 69
4.4.2.2 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON PROTEINEN . 70
INHALTSVERZEICHNIS
VII
4.5 ENZYRRIOLOGISCHE METHODEN 71
4.5.1 BESTIMMUNG DER TRANSAMINASEAKTIVITAET FUER METHYL-
BENZYLAMIN 71
4.5.2 BESTIMMUNG DER TRANSAMINASEAKTIVITAET FUER ZIELKE-
TONE 73
4.6 ANALYTISCHE METHODEN 74
4.6.1 HOCHLEISTUNGSFLUESSIGKEITSCHROMATOGRAPHIE 74
4.6.2 BERECHNUNG DER ENZYMAKTIVITAET AUS HPLC-DATEN . . 76
4.7 MASSENSPEKTROMETRIE 77
4.7.1 MALDI-TOF 78
4.7.2 ESI-MS 78
5 ERGEBNISSE 81
5.1 SUBSTRAT-BINDENDE AMINOSAEUREN DER ^4CAPA 81
5.1.1 ERSTELLUNG EINES STRUKTURMODELLS 82
5.1.2 IDENTIFIZIERUNG SUBSTRAT-BINDENDER RESTE DURCH STRUK
TURVERGLEICH 83
5.1.3 EXPERIMENTELLE VALIDIERUNG DER AUSGEWAEHLTEN RESTE . 88
5.2 R.EINIGUNG DER /ICAPA 93
5.3 SUBSTRATSPEZIFITAET DER WILDTYP-^ICAPA 96
5.4 EINFLUSS VERSCHIEDENER POSITIONEN AUF DIE SUBSTRATSPEZIFITAET
VON ,4CAPA 100
5.4.1 SUCHE NACH VARIANTEN MIT AKTIVITAET FUER BUTYROPHENONLOO
5.4.2 UNTERSUCHUNG EINZELNER POSITIONEN 103
5.4.2.1 POSITION 25 107
5.4.2.2 POSITION 328 110
5.4.2.3 POSITION 164 114
5.5 IN SILICO UNTERSUCHUNGEN DES BINDUNGSMODUS VON YLCAPA
UND VERSCHIEDENEN SUBSTRATEN 118
5.5.1 VERGLEICH DER KRISTALLSTRUKTUR MIT DEM ERSTELLTEN
MODELL 118
5.5.2 VERGLEICH DER KRISTALLSTRUKTUREN VON ^4CAPA UND
ANDEREN AMIN-PYRUVAT-AMINOTRANSFERASEN 119
5.5.3 DOCKING VON SUBSTRATEN IN DIE KRISTALLSTRUKTUR UND
MOLEKUELDYNAMIKSIMULATIONEN DER KOMPLEXE 121
VIII INHALTSVERZEICHNIS
6 DISKUSSION 127
6.1 SUBSTRAT-BINDENDE RESTE VON ACKPK 127
6.2 SUBSTRATSPEZIFITAET VON ^4CAPA 131
6.3 SUBSTRATINHIBITION BEI DER YLCAPA 139
7 ZUSAMMENFASSUNG 141
8 SUMMARY 149
LITERATURVERZEICHNIS 155
ABBILDUNGSVERZEICHNIS 176
TABELLENVERZEICHNIS 179
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