Die Rolle der hypoxie-induzierten Carboanhydrase IX beim Metabolismus des Glioblastoma multiforme:
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2014
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| adam_text | AUS DER ABTEILUNG
FUER
NEUROCHIRURGIE
PROF. DR. MED. ALEXANDER BRAWANSKI
DER FAKULTAET FUER MEDIZIN
DER UNIVERSITAET REGENSBURG
DIE ROLLE DER HYPOXIE-INDUZIERTEN
CARBOANHYDRASE IX BEIM
METABOLISMUS DES GLIOBLASTOMA MULTIFORME
INAUGURAL-DISSERTATION
ZUR ERLANGUNG DES DOKTORGRADES
DER MEDIZIN
DER
FAKULTAET FUER MEDIZIN
DER UNIVERSITAET REGENSBURG
VORGELEGT VON CAND.MED.
CHRISTINA MARIA KELLNER
2014
HTTP://D-NB.INFO/1054345147
INHALTSVERZEICHNIS
ABBILDUNGSVERZEICHNIS 10
TABELLENVERZEICHNIS 13
1 EINLEITUNG 14
1.1 DAS GLIOBLASTOM
- INZIDENZ UND MORTALITAET 15
1.2 HISTOLOGIE, GLIOMGENESE UND GENETISCHE EIGENSCHAFTEN 16
1.2.1 HISTOLOGIE DES GLIOBLASTOMS 16
1.2.2 GLIOMGENESE UND GENETISCHE EIGENSCHAFTEN DES GLIOBLASTOMA
MULTIFORME 18
1.3 THERAPIE UND
PROGNOSE DES GLIOBLASTOMA MULTIFORME 20
1.4 METABOLISMUS DES GLIOBLASTOMA MULTIFORME 21
1.4.1 DER INTRA-1
EXTRAZELLULAERE PH-GRADIENT 22
1.4.2 DIE INTRATUMORALE HYPOXIE 23
1.5 CARBOANHYDRASE IX UND XII 23
1.5.1 LOKALISATION, FUNKTION UND PATHOPHYSIOLOGIE IM GLIOBLASTOM
23
1.5.2 DIE PROMOTORREGION DER CARBOANHYDRASE IX 26
1.5.3 DIE TRANSKRIPTIONSAKTIVIERUNG VON GENEN
UNTER *TRUE HYPOXIA ..
.30
1.5.4 DIE TRANKSKRIPTIONSAKTIVIERUNG VON GENEN UNTER *MILD HYPOXIA 31
1.6 SPEZIFISCHE, MOLEKULARBIOLOGISCH GEZIELTE THERAPIEN ZUR VERBESSERUNG
DER PROGNOSE DES GLIOBLASTOMS 31
1.7 OTTO HEINRICH WARBURG:
*DIE ENTDECKUNG DER NATUR UND DER FUNKTION DES
ATUMUNGSFERMENTS 35
2.ZIELSETZUNG 38
3 MATERIAL 40
6
3.1 GERAETE 40
3.2 VERBRAUCHSMATERIAL 42
3.3 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 44
3.4 KITS 48
3.5 SIRNAS 48
3.6 ANTIKOERPER FUER WESTERN-BLOT 49
3.7 ANTIKOERPER FUER IMMUNHISTOCHEMIE 49
3.8 OLIGONUKLEOTIDE
- RT-QPCR-PRIMER FUER HUMANE SEQUENZEN 50
3.9 TUMORZELLLINIE 50
3.10 SOFTWARE 51
4 METHODEN 52
4.1 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 52
4.1.1 ZELLKULTUR 52
4.1.1.1 KULTUR UND PASSAGE DER U251
GLIOBLASTOMZELLLINIE 52
4.1.1.2 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL
UND VITALITAET VON ZELLEN 53
4.1.1.3 ZELLEN EINFRIEREN UND AUFTAUEN 54
4.2 ZELLKULTUR 55
4.2.1 ANZUCHT UND KULTUR VON VERSUCHSZELLEN 55
4.2.2 NORMOXIE- UND HYPOXIE-BEHANDLUNG DER VERSUCHSZELLEN 57
4.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 58
4.3.1 METHODEN DER RNA-ISOLIERUNG 58
4.3.2 REVERSE TRANSKRIPTION (CDNA-SYNTHESE) 60
4.3.3 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 61
4.3.3.1 EIGENSCHAFTEN DER AUSGEWAEHLTEN PRIMER 62
4.3.3.2 REAKTIONSANSATZ UND REAKTIONSBEDINGUNGEN 62
4.3.3.3 OPTISCHE QUANTIFIZIERUNG UEBER AGAROSEGEL 63
4.3.3.4 BENOETIGTE PUFFER UND LOESUNGEN 64
4.3.4 REAL-TIME QUANTITATIVE PCR (RT-QPCR) 65
4.4 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 68
4.4.1 PROTEINLYSATE IN RIPA-PUFFER 69
4.4.2 PROTEINBESTIMMUNG 70
4.4.3 SDS-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 70
4.4.3.1 BENOETIGTE PUFFER UND LOESUNGEN 72
7
4.4.4 WESTERN-BLOT 73
4.4.4.1 BENOETIGTE PUFFER UND
LOESUNGEN 75
4.5 TRANSFEKTION DER U-251 ZELLLINIE MIT
CALX-SPEZIFISCHER SIRNA 76
4.5.1 AQ-ASSAY 79
4.6 IMMUNFLUORESZENZ 83
4.6.1 NORMOXIE- UND
HYPOXIEBEHANDLUNG DER NICHT-TRANSFIZIERTEN
U-251 ZELLLINIE AUF COVERSLIPS 83
4.6.2 NORMOXIE- BZW. HYPOXIEBEHANDLUNG DER MIT SIRNA TRANSFIZIERTEN
U-251 ZELLLINIE AUF COVERSLIPS 84
4.6.3 VORBEREITUNG DER IMMUNFLUORESZENZ DER NICHT-TRANSFIZIERTEN
UND
TRANSFIZIERTEN U-251 ZELLLINIE AUF COVERSLIPS 85
5 ERGEBNISSE 87
5.1 GENETISCHE MODULATION DER CARBOANHYDRASE IX IN GLIOBLASTOMZELLEN..87
5.1.1 STABILE
HOCHREGULATION DER CA IX AUF MRNA-EBENE
BEI
HYPOXISCHER STOFFWECHSELLAGE 87
5.1.1.1 OPTISCHE QUANTIFIZIERUNG UEBER AGAROSEGEL 87
5.1.1.2 QUANTITATIVE ANALYSE MITTELS RT-QPCR 88
5.1.2 STABILE HOCHREGULATION DER
CA IX AUF PROTEIN-EBENE BEI
HYPOXISCHER STOFFWECHSELLAGE 90
5.2 KNOCKDOWN DES ENZYMS
CA IX IN U251-GLIOBLASTOMZELLEN
DURCH EINSATZ
DER SIRNA-TECHNOLOGIE 91
5.2.1 AUSWIRKUNGEN VERSCHIEDENER KULTURBEDINGUNGEN UND ZUSAETZE VON
DIAMOX AUF DAS ZELLUEBERLEBEN
DER U-251 ZELLLINIE 93
5.2.2 AUSWIRKUNGEN VERSCHIEDENER KULTURBEDINGUNGEN UND ZUSAETZE VON
SIRNA AUF DAS ZELLUEBERLEBEN DER U-251
ZELLLINIE 96
5.3 NACHWEIS DER CA IX-EXPRESSION UND DEREN
LOKALISATION IN
ZELLKOMPARTIMENTEN DER U-251 ZELLLINIE 99
6 DISKUSSION 102
6.1 ALLGEMEINER STOFFWECHSEL UND METABOLISCHE ACHILLESFERSE DER
GLIOME
V.
102
6.2 GESTEIGERTE GLYKOLYSE UND
LAKTATPRODUKTION IM GLIOBLASTOM 105
6.2.1 SPEZIFISCHE METABOLISCHE PARAMETER DES GLIOBLASTOMS
UND DEREN
URSACHEN 105
6.3 EIGENSCHAFTEN DER CARBOANHYDRASE IX 110
6.4 THERAPEUTISCHE KONSEQUENZEN 112
8
7 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 116
8 SUMMARY AND CONCLUSIONS 119
9 LITERATURVERZEICHNIS 121
10 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 139
11 DANKSAGUNG 145
12 CURRICULUM VITAE 148
9
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