Gezielte Attenuierung und Markierung von Viren der klassischen Schweinepest durch Mutation: Ansätze zur Entwicklung einer neuartigen Vakzine gegen das Virus der klassischen Schweinepest zur Differenzierung infizierter von vakzinierten Tieren
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Berlin
Mensch und Buch Verl.
2013 [erschienen] 2014
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INHALTSVERZEICHNIS 5
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 9
ZUSAMMENFASSUNG 14
SUMMARY 16
1.0 EINLEITUNG 19
1.1 PESTIVIREN 19
1.1.1 MORPHOLOGIE UND GENOMAUFBAU 20
1.1.2 DAS NICHTSTRUKTURPROTEIN N
PR
22
1.1.3 DAS GLYKOPROTEIN E
,NS
23
1.1.4 DAS GLYKOPROTEIN E2 24
1.2 DIE KLASSISCHE SCHWEINEPEST 25
1.3 *PERSISTENZ DURCH IMMUNEVASION 26
1.4 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 27
2.0 MATERIAL UND METHODEN 28
2.1 MATERIAL 28
2.1.1 GERAETE 28
2.1.2 CHEMIKALIEN 30
2.1.3 MEDIEN, LOESUNGEN UND PUFFER 32
2.1.4 BIOLOGISCHE MATERIALIEN 35
2.1.4.1 ENZYME 35
2.1.4.2 BAKTERIEN 35
2.1.4.3 ANTIKOERPER 35
2.1.5 OLIGONUKLEOTIDE 36
2.1.6 PLASMIDE 38
2.1.6.1 BEREITS IM LABOR VORHANDENE ODER KOMMERZIELL ERWORBENE PLASMIDE
38
2.1.6.2 SELBST GENERIERTE PLASMIDE 39
2.1.7 VORGEFERTIGTE KOMPLETTSYSTEME 40
2.1.8 ZELLLINIEN 41
2.1.9 VIREN DER KLASSISCHEN SCHWEINEPEST (CSFV) 41
2.1.9.1 CSF WILDTYP-VIREN 41
2.1.9.2 REKOMBINANTE CSFV-MUTANTEN 41
2.1.9.3 VERSUCHSTIERE 42
2.1.9.3.1 FLI TUEBINGEN 42
2.1.9.3.2 FLI INSEL RIEMS 42
2.1.10 MEDIKAMENTE 42
2.1.11 VERBRAUCHSMATERIAL 42
2.1.12 VERWENDETE SOFTWARE 43
2.2 METHODEN 44
2.2.1 METHODEN FUER DIE HERSTELLUNG NEUER VIRUSMUTANTEN 44
2.2.1.1 POLYMERASE KETTENREAKTION 44
2.2.1.1.1 STANDARD-PCR 44
2.2.1.1.2 QUIK CHANGE-PCR 45
2.2.1.2 AGAROSEGELELEKTROPHORESE 46
2.2.1.3 AUFREINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN MITTELS AGAROSEGELELEKTROPHORESE
46
2.2.1.4 RESTRIKTIONSENZYMSPALTUNG 46
2.2.1.5 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA 48
2.2.1.6 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 48
5
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INHALTSVERZEICHNIS
2.2.1.7 FERTIGUNG VON AGARPLATTEN 48
2.2.1.8 PRODUKTION VON KOMPETENTEN BAKTERIEN 49
2.2.1.9 HITZESCHOCKTRANSFORMATION 49
2.2.1.10 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA 49
2.2.1.10.1 MINI-PRAEPARATION 49
2.2.1.10.2 MIDI-PRAEPARATION 50
2.2.1.11 AUFREINIGUNG VON MINI-PRAEPARATIONEN FUER DIE SEQUENZIERUNG 50
2.2.1.12 SEQUENZIERUNG 51
2.2.1.13 IN W (RO-TRANSKRIPTION 52
2.2.1.14 PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION 53
2.2.1.15 FORMALDEHYD-AGAROSEGELELEKTROPHORESE 54
2.2.1.16 ELEKTROPORATION 54
2.2.2 METHODEN FUER DIE CHARAKTERISIERUNG VON VIREN 55
2.2.2.1 KULTIVIERUNG VON ZELLEN 55
2.2.2.2 INFEKTION VON ZELLEN 55
2.2.2.3 TITRATION VON VIREN UND TITERBERECHNUNG 56
2.2.2.4 WACHSTUMSKURVEN 57
2.2.2.5 EXTRAKTION VIRALER RNA AUS INFIZIERTEN ZELLEN 57
2.2.2.6 REVERSE-TRANSKRIPTASE-PCR (RT-PCR) 57
2.2.3 METHODEN FUER DIE DURCHFUEHRUNG VON TIERVERSUCHEN 59
2.2.3.1 VAKZINATION UND INFEKTION 59
2.2.3.2 RUECKTITRATION VON VAKZINEVIREN 59
2.2.3.3 DETERMINATION DER KLINISCHEN PUNKTZAHL 60
2.2.3.4 KOERPERTEMPERATURMESSUNG 61
2.2.3.5 BLUTENTNAHME 62
2.2.3.6 EUTHANASIE 63
2.2.3.7 ENTNAHME VON ORGANPROBEN 63
2.2.4 METHODEN FUER DIE ANALYSE VON PROBEN AUS TIERVERSUCHEN 63
2.2.4.1 LEUKOZYTENZAEHLUNG 63
2.2.4.2 PRAEPARATION VON LEUKOZYTENKONZENTRAT 65
2.2.4.3 AUFARBEITUNG VON ORGANPROBEN 65
2.2.4.4 VIRUSANZUCHT AUS PROBENMATERIAL IN ZELLKULTUR 65
2.2.4.5 SERUMNEUTRALISATIONSTEST 66
2.2.4.6 KONVENTIONELLE INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ 67
2.2.4.7 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ MITTELS ZEISS AXIOVERT 200M MIT
APOTOME 68
3.0 ERGEBNISSE 69
3.1 CSFV DOPPELMUTANTE 69
3.1.1 GRUNDLAGEN 69
3.1.2 SICHERHEITSSTUDIE MIT TRAGENDEN SAUEN (TV#30) 70
3.1.2.1 CHARAKTERISIERUNG DER IN TV#30 EINGESETZTEN VIREN 71
3.1.2.2 AUSWAHL UND BEZEICHNUNG DER TIERE 71
3.1.2.3 ZEITPLAN 72
3.1.2.4 INFEKTION UND TITRATION DER VIREN FUER VAKZINATION UND
BELASTUNGSINFEKTION 73
3.1.2.5 KOERPERTEMPERATUR UND KLINISCHES BILD DER MUTTERTIERE 74
3.1.2.6 SEROLOGISCHE UNTERSUCHUNG (SNT) 75
3.1.2.7 POSTMORTALE UNTERSUCHUNG DER FETEN 76
3.1.2.8 VIRUSANZUCHT AUS FETALEN ORGANEN 78
3.1.2.9 ZUSAMMENFASSUNG SICHERHEITSSTUDIE (TV#30) 80
3.2 CSFV DIVA-VAKZINE-MUTANTEN 81
3.2.1 TAV-EPITOP-BASISMUTANTEN 81
3.2.1.1 MARKIERUNGSKONZEPT 81
3.2.1.2 KONSTRUKTION DER BENOETIGTEN PLASMIDE 82
3.2.1.3 HERSTELLUNG DER TAV-EPITOP BASISMUTANTEN 84
3.2.1.4 PRUEFUNG DES MARKIERUNGSKONZEPTES 84
3.2.1.4.1 SEQUENZIERUNG 84
3.2.1.4.2 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ 85
3.2.1.5 WACHSTUMSEIGENSCHAFTEN DER TAV-EPITOP BASISMUTANTEN 87
3.2.2 TAV-EPITOP DIVA-VAKZINE KANDIDATEN 87
3.2.2.1 TAV-EPITOP-KOMBINATIONSMUTANTEN 88
6
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.2.1.1 KONSTRUKTION DER BENOETIGTEN PLASMIDE - ANSATZ 1 88
3.2.2.1.2 HERSTELLUNG DER VIRUSMUTANTEN AUS CDNA-KONSTRUKTEN DES ANSATZ
1 90
3.2.2.1.3 KONSTRUKTION DER BENOETIGTEN PLASMIDE - ANSATZ 2 92
3.2.2.1.4 HERSTELLUNG DER VIRUSMUTANTEN AUS CDNA-KONSTRUKTEN DES ANSATZ
2 94
3.2.3 TIEREXPERIMENTELLE STUDIEN MIT CSFV DIVA-VAKZINE-MUTANTEN 95
3.2.3.1 VERGLEICHSSTUDIE TV#31 95
3.2.3.1.1 CHARAKTERISIERUNG DER IN TV#31 EINGESETZTEN VIREN 96
3.2.3.1.2 VERIFIZIERUNG DES MARKIERUNGSKONZEPTES MITTELS INDIREKTER
IMMUNFLUORESZENZ. 97
3.2.3.1.3 WACHSTUMSEIGENSCHAFTEN VIREN TV#31 97
3.2.3.1.4 AUSWAHL UND BEZEICHNUNG DER TIERE 98
3.2.3.1.5 ZEITPLAN 99
3.2.3.1.6 INFEKTION UND TITRATION DER VAKZINEVIREN 101
3.2.3.1.7 KLINISCHE PUNKTZAHL 102
3.2.3.1.8 KOERPERTEMPERATUR 104
3.2.3.1.9 LEUKOZYTENZAEHLUNG 106
3.2.3.1.10 SEROLOGISCHE UNTERSUCHUNG (SNT) 107
3.2.3.1.11 ANALYSE DER AUS LEUKOZYTENKONZENTRAT REISOLIERTEN VIREN 108
3.2.3.1.11.1 ERGEBNIS DER SEQUENZIERUNG 109
3.2.3.1.11.2 ERGEBNIS DER INDIREKTEN IMMUNFLUORESZENZ 110
3.2.3.1.12 ZUSAMMENFASSUNG TV#31 111
3.2.3.2 EFFIZIENZSTUDIE TV#52/12 112
3.2.3.2.1 CHARAKTERISIERUNG DER IN TV#52/12 EINGESETZTEN VIREN 112
3.2.3.2.2 VERIFIZIERUNG DES MARKIERUNGSKONZEPTES MITTELS INDIREKTER
LMMUNFLUORESZENZ113
3.2.3.2.3 WACHSTUMSEIGENSCHAFTEN 114
3.2.3.2.4 AUSWAHL UND BEZEICHNUNG DER TIERE 115
3.2.3.2.5 ZEITPLAN 116
3.2.3.2.6 INFEKTION UND TITRATION DER VIREN FUER VAKZINATION UND
BELASTUNGSINFEKTION 118
3.2.3.2.7 KLINISCHE PUNKTZAHL 119
3.2.3.2.8 KOERPERTEMPERATUR 120
3.2.3.2.9 LEUKOZYTENZAEHLUNG 122
3.2.3.2.10 SEROLOGISCHE UNTERSUCHUNG (SNT) 124
3.2.3.2.11 ANALYSE DER AUS LEUKOZYTENKONZENTRAT REISOLIERTEN VIREN 125
3.2.3.2.11.1 ERGEBNIS DER SEQUENZIERUNG 126
3.2.3.2.11.2 ERGEBNIS DER INDIREKTEN IMMUNFLUORESZENZ 127
3.2.3.2.11.3 ZUSAMMENFASSUNG TV#52 12 129
3.3 DIMERISIERUNG DES E
RNS
-PROTEINS 131
3.3.1 DIMERISIERUNGSNEGATIVE MUTANTEN UND PSEUDOREVERSION 131
3.3.1.1 PATHOGENITAETSSTUDIE TV#29 132
3.3.1.1.1 GENERIERUNG DER BENOETIGTEN VIREN 132
3.3.1.1.2 CHARAKTERISIERUNG DER EINGESETZTEN VIREN 135
3.3.1.1.3 AUSWAHL UND BEZEICHNUNG DER TIERE 136
3.3.1.1.4 ZEITPLAN 136
3.3.1.1.5 INFEKTION UND TITRATION DER VAKZINEVIREN 138
3.3.1.1.6 KLINISCHE PUNKTZAHL 140
3.3.1.1.7 TEMPERATUR 141
3.3.1.1.8 LEUKOZYTENZAEHLUNG 142
3.3.1.1.9 SEROLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN 145
3.3.1.1.10 ANALYSE DER AUS LEUKOZYTENKONZENTRAT REISOLIERTEN VIREN 146
3.3.1.1.11 ZUSAMMENFASSUNG TV#29 147
4.0 DISKUSSION 149
4.1 ANFORDERUNGEN AN EINEN NEUARTIGEN CSFV IMPFSTOFF 149
4.2 DER SONDERFALL DER PERSISTENTEN INFEKTION 150
4.3 DIE INHIBIERUNG DES ANGEBORENEN IMMUNSYSTEMS DURCH N
PR
UND E
MS
151
4.4 BVDV UND CSFV DOPPELDELETIONSMUTANTEN ALS VAKZINE-KANDIDATEN 154
4.5 DIE DIMERISIERUNG DES E
,NS
-PROTEINS ALS VIRULENZFAKTOR VON CSFV 156
4.6 KONVENTIONELLE CSFV LEBENDVAKZINE 160
4.7 CSFV DIVA-VAKZINE 161
4.7.1 EIGENSCHAFTEN DER KOMMERZIELL VERFUEGBAREN CSFV DIVA-VAKZINE 161
4.7.2 AKTUELLE ANSAETZE ZUR ENTWICKLUNG NEUARTIGER CSFV DIVA-VAKZINEN 163
4.7.3 DIE TAV-EPITOP MARKIERTE CSFV DOPPELMUTANTE ALS DIVA-VAKZINE 167
7
INHALTSVERZEICHNIS
ABBILDUNGSVERZEICHNIS 172
TABELLENVERZEICHNIS 173
LITERATURVERZEICHNIS 174
PUBLIKATIONSVERZEICHNIS 183
DANKSAGUNG 184
SELBSTAENDIGKEITSERKLAERUNG 185
8
|
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| institution | BVB |
| isbn | 9783863874940 |
| language | German |
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| publisher | Mensch und Buch Verl. |
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| spelling | Wirtz, Sabine Verfasser (DE-588)1053379056 aut Gezielte Attenuierung und Markierung von Viren der klassischen Schweinepest durch Mutation Ansätze zur Entwicklung einer neuartigen Vakzine gegen das Virus der klassischen Schweinepest zur Differenzierung infizierter von vakzinierten Tieren vorgelegt von Sabine Wirtz Directed attenuation and labelling of classical swine fever virus via mutation Berlin Mensch und Buch Verl. 2013 [erschienen] 2014 185 S. graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Nebentitel: Directed attenuation and labelling of classical swine fever virus via mutation Berlin, Freie Univ., Diss., 2014 pigs cabt classical swine fever virus cabt live vaccines cabt recombination cabt markers cabt Schweinepest-Virus (DE-588)4445053-9 gnd rswk-swf Impfstoff (DE-588)4026655-2 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Schweinepest-Virus (DE-588)4445053-9 s Impfstoff (DE-588)4026655-2 s DE-604 Erscheint auch als Online-Ausgabe urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000096952-8 http://www.diss.fu-berlin.de/diss/receive/FUDISS_thesis_000000096952 kostenfrei Volltext DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=027404511&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
| spellingShingle | Wirtz, Sabine Gezielte Attenuierung und Markierung von Viren der klassischen Schweinepest durch Mutation Ansätze zur Entwicklung einer neuartigen Vakzine gegen das Virus der klassischen Schweinepest zur Differenzierung infizierter von vakzinierten Tieren pigs cabt classical swine fever virus cabt live vaccines cabt recombination cabt markers cabt Schweinepest-Virus (DE-588)4445053-9 gnd Impfstoff (DE-588)4026655-2 gnd |
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