Klonierung und Charakterisierung eines Phagenlysins und sein Einsatz zur diagnostischen Erkennung von Bacillus anthracis:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Gießen
VVB Laufersweiler Verlag
2013
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I
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
2 LITERATUR 3
2.1 DER MILZBRAND 3
2.1.1 GESCHICHTE UND GEGENWART 3
2.1.2 EIGENSCHAFTEN VON B. ANTHRACIS 6
2.1.3 PATHOGENESE UND KLINIK 8
2.1.4 ENG VERWANDTE BACILLUS- SPEZIES 12
2.2 IDENTIFIZIERUNG VON BACILLUS ANTHRACIS 14
2.2.1 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 14
2.2.2 SEROLOGISCHE METHODEN 16
2.2.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 16
2.2.4 SONSTIGE METHODEN 17
2.2.5 ZUSAMMENFASSUNG DER DIAGNOSTIKMETHODEN 18
2.3 THERAPIE UND PROPHYLAXE DES MILZBRANDS 20
2.4 BAKTERIOPHAGEN 21
2.4.1 DIE ENTDECKUNG DER PHAGEN 21
2.4.2 LYSEWIRKUNG DER PHAGEN 21
2.4.3 BEKANNTE PHAGEN UND IHRE ANWENDUNG 22
2.4.4 PHAGEN VON S. ANTHRACIS 23
2.5 PHAGENLYSINE 26
2.5.1 DEFINITION UND EIGENSCHAFTEN VON LYSINEN 26
2.5.2 BEKANNTE PHAGENLYSINE IN DER ANWENDUNG 28
2.5.3 B. ANFFRRAC/S-SPEZIFISCHE PHAGENLYSINE 29
3 MATERIAL UND METHODEN 31
3.1 MATERIAL 31
3.1.1 CHEMIKALIEN, PUFFER UND KITS 31
3.1.2 BAKTERIENSTAEMME 31
3.1.3 BAKTERIOPHAGE 34
3.1.4 PLASMIDE UND VEKTOREN 34
3.1.5 ANTIBIOTIKA 36
3.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 37
3.2.1 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) FUER DIE KLONIERUNG 37 3.2.2
RESTRIKTIONSSPALTUNG VON DNA 38
3.2.3 LIGATION 38
3.2.4 HERSTELLUNG KOMPETENTER E. COLI- ZELLEN 38
3.2.5 TRANSFORMATION 39
3.2.6 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA 39
3.2.7 DNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 39
3.2.8 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 40
3.2.9 HERSTELLUNG REKOMBINANTER PROTEINE 40
3.3 PROTEINANALYTISCHE METHODEN 42
3.3.1 PROTEINAUFREINIGUNG 42
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IMAGE 2
3.3.2 METHODEN ZUM UMPUFFERN VON PROTEINLOESUNGEN 44
3.3.3 METHODEN ZUR BESTIMMUNG VON PROTEINKONZENTRATIONEN 45 3.3.4
SDS-PAGE 46
3.4 ENDOTOXINBESTIMMUNG UND -ENTFERNUNG 47
3.4.1 ENDOTOXINBESTIMMUNG 47
3.4.2 ENTFERNUNG DES ENDOTOXINS 47
3.5 DIAGNOSTISCHE METHODEN 48
3.5.1 VARIANTEN DES Y-PHAGENTESTS 48
3.5.2 SPORENFAERBUNG 50
3.5.3 NACHWEIS DER KAPSELBILDUNG 50
3.5.4 LIGHTCYCLER-PCR 51
3.5.5 BESTIMMUNG DER KEIMZAHL 54
3.6 ANWENDUNG DES RPLYG 55
3.6.1 RPLYG-LYSETEST MITTELS PHOTOMETRISCHER TRUEBUNGSMESSUNG VON
FLUESSIGKULTUREN 55
3.6.2 RPLYG-AKTIVITAETSTEST 56
3.6.3 ENTWICKLUNG DES KOLORIMETRISCHEN RPLYG-LYSETESTS 57 3.6.4 WIRKUNG
DES RPLYG AUF BEKAPSELTE ISOLATE 60
3.6.5 EINSATZ DES RPLYG ZUR DNA-PRAEPARATION AUS BAKTERIEN 60
3.7 UNTERSUCHUNG DER LANGZEITLAGERUNG DES RPLYG 62
3.7.1 ANWENDUNG UNTERSCHIEDLICHER LAGERPUFFER 62
3.7.2 LAGERUNG NACH LYOPHILISATION 62
ERGEBNISSE 63
4.1 HERSTELLUNG DES REKOMBINANTEN PLYG 63
4.1.1 KLONIERUNG DES RPLYG IN EINEN E. COFRSTAMM 63
4.1.2 EXPRESSIONSTEST 64
4.1.3 AUFREINIGUNG MITTELS FPLC 67
4.1.4 ENTFERNUNG VON ENDOTOXIN 70
4.2 VORVERSUCHE ZUR ENTWICKLUNG EINES DIAGNOSTISCHEN RPLYG-LYSETESTS ..
70 4.2.1 ERMITTLUNG DER OD 6OO-ABNAHME ZUM NACHWEIS DER LYSE 70 4.2.2
OPTIMIERUNG DER LYSEBEDINGUNGEN 71
4.2.2.1 REAKTIONSMEDIUM 72
4.2.2.2 PH-WERT 73
4.2.2.3 TEMPERATUR 73
4.2.2.4 WACHSTUMSPHASE 74
4.2.2.5 BAKTERIENDICHTE 76
4.2.2.6 RPLYG-KONZENTRATION 77
4.2.3 ZUSAETZLICHE ANWENDUNG EINER POLYPROPYLENFOLIE 78
4.3 PRUEFUNG DER BACILLUS- ISOLATE IM TURBIDIMETRISCHEN RPLYG-LYSETEST
(VARIANTE 2) 79
4.3.1 ERGEBNISSE DER BACILLUS SPP. (NICHT B. ANTHRACIS)- ISOLATE 79
4.3.2 ERGEBNISSE DER B. ANTHRACIS- SO AIE 81
4.4 ENTWICKLUNG DES KOLORIMETRISCHEN RPLYG-LYSETESTS 83
4.4.1 OPTIMIERUNG EINZELNER UNTERSUCHUNGSPARAMETER 83 4.4.2 ENDGUELTIGES
PROTOKOLL DES KOLORIMETRISCHEN RPLYG-LYSETESTS 87 4.4.3 DEFINITION DES
GRENZWERTES 87
IMAGE 3
III
4.5 PRUEFUNG DER BACILLUS SPP.-LSOLATE IM KOLORIMETRISCHEN
RPLYG-LYSETEST. 89
4.5.1 ERGEBNISSE DER B. ANTHRACIS- ISOLATE IM KOLORIMETRISCHEN
RPLYGLYSETEST 89
4.5.2 ERGEBNISSE VON TSOLATEN ANDERER BACILLUS SPP. IM KOLORIMETRISCHEN
RPLYG-LYSETEST 93
4.6 PRUEFUNG DER BACILLUS SPP.-LSOLATE IM Y-PHAGENTEST 98
4.6.1 ERGEBNISSE DER B. ANTHRACIS- SO ATE IM Y-PHAGENTEST 98 4.6.2
ERGEBNISSE DER ANDEREN BACILLUS SPP.-LSOLATE IM Y-PHAGENTEST 99
4.7 VERGLEICH DER ERGEBNISSE DER BACILLUS SPP.-LSOLATE IN DEN
ANGEWENDETEN TESTMETHODEN 99
4.7.1 VERGLEICH DER ERGEBNISSE DER B. ANTHRACIS- ISOLATE IM
KOLORIMETRISCHEN RPLYG-LYSETEST UND IM Y-PHAGENTEST 99 4.7.2 VERGLEICH
DER ERGEBNISSE DER ANDEREN BACILLUS SPP.-LSOLATE IN DEN EINZELNEN
RPLYG-LYSETESTS UND IM Y-PHAGENTEST 100
4.8 KORRELATION ZWISCHEN DEN HAEMOLYTISCHEN EIGENSCHAFTEN DER BACILLUS
ISOLATE UND IHREN ERGEBNISSEN IM KOLORIMETRISCHEN RPLYG-LYSETEST.... 103
4.9 WIRKUNG DES RPLYG AUF BEKAPSELTE ZELLEN VON B. ANTHRACIS 105
4.10 WIRKUNG DES RPLYG AUF SPOREN VON B. ANTHRACIS 108
4.11 ANWENDUNG DES RPLYG ZUR DNA-PRAEPARATION AUS VEGETATIVEN ZELLEN VON
B. ANTHRACIS 109
4.12 DEFINITION EINER EINHEIT FUER DAS RPLYG 112
4.13 UEBERPRUEFUNG DER LANGZEITLAGERUNG DES RPLYG 114
4.13.1 UEBERPRUEFUNG DER STABILITAET DES RPLYG IN UNTERSCHIEDLICHEN
LAGERPUFFERN 114
4.13.2 LYOPHILISATION DES RPLYG ZUR ERHOEHUNG DER STABILITAET BEI LAGERUNG
116
5 DISKUSSION 117
5.1 REKOMBINANTE HERSTELLUNG DES RPLYG 117
5.2 SPEZIFITAET UND SENSITIVITAET DES RPLYG IM VERGLEICH ZUM Y-PHAGEN 121
5.3 VERGLEICHE IN DER ANWENDUNG VON Y-PHAGE UND RPLYG 124
5.4 ENTWICKLUNG EINES DIAGNOSTIKTESTS 127
5.4.1 ERSTE VERSUCHE MIT RPLYG ALS DIAGNOSTISCHES NACHWEISREAGENZ FUER SS.
ANTHRACIS 128
5.4.2 METHODEN ZUM INDIREKTEN NACHWEIS DER LYSE DURCH RPLYG 130 5.4.3
ENTWICKLUNG DES ENDGUELTIGEN KOLORIMETRISCHEN RPLYG-LYSETESTS.... 131
5.5 ANWENDUNG DES KOLORIMETRISCHEN RPLYG-LYSETESTS IN DER
ROUTINEDIAGNOSTIK 133
5.6 WIRKUNG DES RPLYG AUF BEKAPSELTE BAKTERIENZELLEN 135
5.7 WIRKUNG DES RPLYG AUF SPOREN 136
5.8 LAGERFAEHIGKEIT 137
5.9 SCHLUSSFOLGERUNGEN UND AUSBLICK 138
6 ZUSAMMENFASSUNG 139
IMAGE 4
IV
7 SUMMARY 141
8 LITERATURVERZEICHNIS 143
9 ANHANG 156
9.1 VERWENDETE MEDIEN, CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIALIEN 156
9.2 EIGENSCHAFTEN DER VERWENDETEN BACILLUS- ISOLATE 161
9.2.1 B. ANTHRACIS- SO ATE 161
9.2.2 ANDERE BACILLUS SPP.-LSOLATE 166
9.3 VERWENDETE VEKTORPLASMIDE 172
9.4 ERMITTELTE SEQUENZ FUER DAS PLASMID PQE60PLYG 174
10 DANKSAGUNG 178
11 ERKLAERUNG 180
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| spelling | Boll, Kerstin Verfasser aut Klonierung und Charakterisierung eines Phagenlysins und sein Einsatz zur diagnostischen Erkennung von Bacillus anthracis Kerstin Boll Gießen VVB Laufersweiler Verlag 2013 XII, 180 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Zugl.: Gießen, Univ., Diss., 2013 Bacillus anthracis cabt Anthrax cabt Bacillus (Bacteria) cabt DNA cloning cabt Diagnosis cabt diagnostic techniques cabt Milzbrand (DE-588)4298868-8 gnd rswk-swf Bacillus anthracis (DE-588)4203881-9 gnd rswk-swf Diagnose (DE-588)4012040-5 gnd rswk-swf Bakteriophagen (DE-588)4125508-2 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Milzbrand (DE-588)4298868-8 s Bacillus anthracis (DE-588)4203881-9 s Bakteriophagen (DE-588)4125508-2 s Diagnose (DE-588)4012040-5 s DE-604 DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=027376218&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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