Gentechnische Herstellung und Charakterisierung der Hämolysine von Brachyspira hyodysenteriae:
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| Published: |
Gießen
VVB Laufersweiler
2013
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INHALTSVERZEICHNIS I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS I
VERZEICHNIS DER ABKUERZUNGEN IV
1 EINLEITUNG 1
2 SCHRIFTTUM 3
2.1 SCHWEINEDYSENTERIE (ALLGEMEIN) 3
2.2 WIRKUNGSWEISE DER HAEMOLYSINE VON BAKTERIEN 6
2.3 HAEMOLYSINE DER BRACHYSPIREN 9
2.3.1 DIE HAEMOLYSINE TLYA, TLYB UND TLYC 10
2.3.2 DAS HAEMOLYSIN HLYA 11
2.3.3 LOKAIISATION DER HAEMOLYSINE 12
2.4 HAEMOLYSINE DER LEPTOSPIREN 13
2.4.1 HAEMOLYSINE MIT SPHINGOMYELINASEAKTIVITAET 14
2.4.2 HAEMOLYSINE OHNE SPHINGOMYELINASEAKTIVITAET 16
2.5 . HAEMOLYSINE DER BORRELIEN 17
2.6 HAEMOLYSINE BEI TREPONEMEN 19
2.7 SCHLUSSFOLGERUNGEN 21
3 MATERIAL UND METHODEN 22
3.1 MATERIALIEN 22
3.1.1 VERBRAUCHSMATERIALIEN UND PUFFER 22
3.1.2 BAKTERIENSTAEMME 22
3.1.3 GENTECHNISCH VERAENDERTE MIKROORGANISMEN (GVOS) 22
3.1.4 PLASMIDE 23
3.1.5 ZELLLINIEN 25
3.1.6 TIERE 25
3.2 BAKTERIOLOGISCHE METHODEN 25
3.2.1 ANZUCHT VON BAKTERIEN 25
3.2.2 PRUEFUNG AUF VORLIEGEN EINES CAMP-PHAENOMENS 27
3.2.3 KEIMZAHLBESTIMMUNG 28
3.2.4 REINHEITSKONTROLLE 29
3.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 29
3.3.1 PRAEPARATION VON DNS AUS BAKTERIENKULTUREN 29
3.3.2 DNS-BESTIMMUNG 29
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II INHALTSVERZEICHNIS
3.3.3 RESTRIKTION VON DNS 30
3.3.4 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 30
3.3.5 PRIMER 31
3.3.6 AGAROSEGELELEKTROPHORESE 34
3.3.7 DNS-KLONIERUNG 34
3.3.8 DNS-SEQUENZIERUNG 35
3.4 PROTEINANALYTISCHE METHODEN 35
3.4.1 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION 35
3.4.2 SDS-PAGE (SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE) 35
3.4.3 LOESLICHKEITSANALYSEN VON CO//-PROTEINEN 36
3.4.4 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHISCHE REINIGUNG VON REKOMBINANTEN PROTEINEN
AN EINER
NI
2+
-NTA-MATRIX 36
3.4.5 HERSTELLUNG VON HE-EXTRAKTEN 38
3.4.6 PROTEINFAELLUNG AUS DEM OBERSTAND 39
3.5 SEROLOGISCHE METHODEN 39
3.5.1 KONJUGATE 39
3.5.2 SERUMABSORPTION 39
3.5.3 WESTERNBLOT 40
3.5.4 IMMUNOBLOT 40
3.5.5 VERWENDETE SEREN 41
3.6 ZELLKULTURMETHODEN 41
3.6.1 KULTIVIERUNG UND ARCHIVIERUNG DER ZELLEN 41
3.6.2 TOXIZITAETSTESTS 43
3.7 TIEREXPERIMENTELLE METHODEN 44
3.7.1 TIERHALTUNG 44
3.7.2 HERSTELLUNG DER IMPFSTOFFE 45
3.7.3 HERSTELLUNG RHAEMOLYSIN-SPEZIFISCHER ANTISEREN IM KANINCHEN 45
3.8 DATENHALTUNG UND AUSWERTUNG 46
3.8.1 BILDDOKUMENTATION UND AUSWERTUNG 46
3.8.2 AUSWERTUNG VON DNS-SEQUENZDATEN 46
4 ERGEBNISSE 47
4.1 VORKOMMEN VERSCHIEDENER HAEMOLYSINGENE BEI B. HYODYSENTERIAE-SEROTYP-
REFERENZSTAEMMEN 47
4.2 KLONIERUNG UND EXPRESSION DER B. HYODYSENFER/AE-HAEMOLYSINGENE IN E.
COLI 47
4.2.1 KLONIERUNG 47
4.2.2 KLONIERUNGSSTRATEGIE FUER DIE HLYA-TRANSFORMANTEN 49
4.2.3 PROTEINEXPRESSION UND -REINIGUNG 51
INHALTSVERZEICHNIS III
4.2.4 OPTIMIERUNG DER PROTEINEXPRESSION 57
4.2.5 PROTEINGEHALTE DER EXPRIMIERTEN UND GEREINIGTEN REKOMBINANTEN
HAEMOLYSIN-
PRAEPARATIONEN 57
4.3 ERGEBNISSE DER IMMUNISIERUNGSVERSUCHE 58
4.3.1 IMMUNANTWORT VON KANINCHEN NACH IMMUNISIERUNG MIT RHAEMOLYSINEN VON
B.
HYODYSENTERIAE 58
4.3.2 SEROLOGISCHE KREUZREAKTIONEN ZWISCHEN DEN RHAEMOLYSINEN 60
4.4 NACHWEIS VERSCHIEDENER HAEMOLYSINE BEI UNTERSCHIEDLICHEN B.
HYODYSENTERIAE-
SEROTYPEN UNTER VERWENDUNG DER RHAEMOLYSIN-ANTISEREN 61
4.5 NACHWEIS VON ANTIKOERPERN GEGEN DIE VERSCHIEDENEN RHAEMOLYSINE VON B.
HYODYSENTERIAE BEI SCHWEINEN 64
4.5.1 SEREN REKONVALESZENTER SCHWEINE (ANTISERUMPOOL) UND EXPERIMENTELL
INFIZIERTER
FERKEL 64
4.5.2 ANTIKOERPERNACHWEIS GEGEN VERSCHIEDENE RHAEMOLYSINE IN SEREN VON
SCHWEINEN
VOR UND NACH INTRAGASTRALER EXPERIMENTELLER INFEKTION MIT B.
HYODYSENTERIAE 65
4.6 HAEMOLYTISCHE AKTIVITAET DER TRANSFORMANTEN UND DER GEREINIGTEN
RHAEMOLYSINE IM
VERGLEICH ZU EINEM HAEMOLYSINEXTRAKT AUS B. HYODYSENTERIAE 67
4.6.1 PRUEFUNG DER HAEMOLYTISCHEN AKTIVITAET DES B204-HE-EXTRAKTS (POSITIVE
KONTROLLE) 67
4.6.2 HAEMOLYSINBILDUNG DER TRANSFORMANTEN BEI VERMEHRUNG AUF
VERSCHIEDENEN, FESTEN
NAEHRMEDIEN 70
4.6.3 UNTERSUCHUNG DER TRANSFORMANTEN IM CAMP-TEST 72
4.6.4 HAEMOLYSE-INDUKTION DER RHAEMOLYSINE IM HAEMOLYSE-ASSAY 74
4.6.5 ZYTOTOXIZITAET DER RHAEMOLYSINE 75
5 DISKUSSION 77
6 ZUSAMMENFASSUNG 88
7 SUMMARY 90
8 LITERATURVERZEICHNIS 92
9 ANHANG 100
10 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 106
10.1 ABBILDUNGEN 106
10.2 TABELLEN 107
DANKSAGUNG 109 |
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