Interaktionen der Nidogene mit Laminin, Perlecan und Kollagen Typ IV:
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2014
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| adam_text | Titel: Interaktionen der Nidogene mit Laminin, Perlecan und Kollagen Typ IV
Autor: Keller, Manuel Vasco
Jahr: 2014
Zusammenfassung
1
Abstract_2
1 Einleitung_3
1.1 Die Basalmembran_3
1.2 DieNidogene_4
1.3 Die Laminine_6
1.4 Die Interaktion zwischen Laminin und Nidogen_ 10
1.5 Die Interaktion zwischen Kollagen IV und Nidogen_ 12
1.6 Die Interaktion zwischen Perlecan und Nidogen_ 14
1.7 Das Basalmembranmodell - Struktur und Assemblierung_15
1.8 Konsequenzen verschiedener KO-Mausmodelle für das
klassische Basalmembranmodell_ 17
1.9 Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Spektroskopie_ 19
1.10 Ziel der Arbeit_21
2 Ergebnisse_23
2.1 Analyse der Bindung von Nidogenen an den kurzen Laminin yl Arm_23
2.1.1 Identifikation der Nidogenbindedomänen für den kurzen Laminin yl Arm_23
2.1.2 Identifikation der Nidogenbindedomäne auf dem kurzen Laminin yl Arm_25
2.1.3 Einfluss der Punktmutanten N802S und N802D im kurzen Laminin yl Arm auf
die Bindung zu den Nidogenen_27
2.2 Einfluss der Nidogene und ihrer Domänen auf die Verknüpfung anderer
Basalmembrankomponenten in vitro_30
2.2.1 Bindung der Nidogene an Kollagen Typ IV und Bildung von trimeren Komplexen mit Kollagen
Typ IV und Laminin yl_30
2.3 Interaktionen der Nidogene mit anderen kurzen Armen der Laminine_34
2.3.1 Identifizierung von Interaktionen zwischen zwei Bindungspartnern mittels
Affinitätspräzipitation aus Zellkulturmedien _34
2.3.2 Untersuchung der Bindung der Nidogene an die kurzen Laminin Arme mittels
Affinitätschromatographie aus Zellkulturmedien_36
2.3.3 Charakterisierung der Bindung der Nidogene an die kurzen Arme der Laminin a4, a5 und y3
Kette in ELISA ähnlichen Bindungsstudien_39
2.3.4 Identifikation der Nidogenbindedomänen für die kurzen Arme
der Laminin a4, a5 und y3 Ketten_41
2.3.5 Eingrenzung der Bindungsdomänen für die Nidogene auf dem kurzen Arm
der Laminin x4 und x5 Kette anhand eines Sequenzvergleichs_44
2.3.6 Identifikation der für die Bindung an Nidogene essentiellen Aminosäuren in
den kurzen Armen der Laminin a4 und a5 Kette_46
2.4 Interaktionsstudien der kurzen Arme der Laminin ct4 und a5 Kette mit Nidogenen und
ihren Fragmenten mittels Oberflächen-Plasmon-Resonanz_52
2.4.1 Interaktionsstudien mit dem kurzen Arm der Laminin a4 Kette und den Fragmenten der
Nidogene _______52
2.4.2 Interaktionsstudien mit dem kurzen Arm der Laminin x5 Kette und den Fragmenten der
Nidogene_____55
2.5 Untersuchung der Bindung der Nidogene an Perlecan_58
2.5.1 Untersuchung der Bindefähigkeit der Nidogene an die Fragmente des Perlecans in einem
Interaktionstest mit Zellkulturüberständen____59
2.5.2 Untersuchung der Bindung der Nidogene an die Fragmente des Perlecans in ELISA ähnlichen
Bindestudien_61
2.5.3 Interaktionsstudien für die Bindung zwischen den Fragmenten der Nidogene und
der Perlecan Domäne IV-1 mittels SPR_63
2.6 Analyse der Nidogenbinderegionen auf den kurzen Armen der Lamlnln a4 und x5 Kette
anhand von Homologiemodelling_65
2.6.1 Homologiemodelling der G3 Domäne von Nidogen 2_67
2.6.2 Homologiemodelling der Fragmente Laminin a4 LE 2-4 und Laminin a5 LEc 2-4_68
2.6.3 Analyse der Binderegionen im potentiellen Komplex der modellierten Laminin a4 LE 2-4
und a5 LEc 2-4 Fragmente mit den G3 Domänen von Nidogen 1 und 2_70
2.7 Untersuchung der Relevanz der Laminin a4 und aS Interaktion mit den Nidogenen im in
vivo Kontext der Maus_74
2.7.1 Kompetitionsexperimente mit Fragmenten der Laminin a4, a5 und yl Ketten auf
embryonalen Gewebeschnitten der Haut aus Maus_74
3 Diskussion_77
3.1 Nidogen 1 und 2 sind Adapterproteine mit unterschiedlichen Bindeeigenschaften_78
3.2 Identifizierung von neuen Bindungspartnern der Nidogene_81
3.3 Die Nidogenbindestelle der Laminin a4 und a5 Kette befindet sich analog zum
Nidogenbindemodul der Laminin yl Kette auf einem einzigen EGF Modul_86
3.4 Relevanz der Laminin-Nidogen Bindung im in vivo Kontext der Basalmembran_89
3.5 Ausblick_94
4 Materiai und Methoden_95
4.1 Material_95
4.1.1 Puffer und Lösungen_95
4.1.2 Nährmedium für Bakterien_97
4.1.3 Bakterienstämme_98
4.1.4 Expressionsvektoren_98
4.1.5 Oligonukleotide_____99
4.1.6 Primär- und Sekundärantikörper_100
4.1.7 Molekulargewichtsstandard___100
4.2 Molekularbiologische Arbeiten_101
4.2.1 Plasmid-DNA-Präparation aus Bakterien_101
4.2.2 Restriktionsverdau von DNA______101
4.2.3 Agarosegelelektrophorese________101
4.2.4 Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen_101
4.2.5 DNA-Sequenzierung___102
4.2.6 Konzentrationsbestimmung von DNA_102
4.2.7 Ligation ______102
4.2.8 Transformation von Bakterien mittels Hitzeschock___ 102
4.2.9 Herstellung transformationskompetenter Bakterien _103
4.2.10 Polymerasekettenreaktion (PCR)__103
4.2.11 Mutaeenese PCR _105
4.2.12 Klonierung von Laminin Konstrukten _105
4.3 Zellkulturarbeiten _ 106
4.3.1 Passagierung und Kultivierung von HEK-293-EBNA Zellen_106
4.3.2 Kryokonservierung _________107
4.3.3 Transfektion und Selektion _107
4.3.4 Ernte von Zellkulturüberständen_108
4.3.5 Interaktionsexperimente mit Zellkulturüberständen_108
4.4 Proteinbiochemische Arbeiten______109
4.4.1 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)_109
4.4.2 Western-Blot Analyse_110
4.4.3 Proteinfärbung mit Coomassie___111
4.4.4 Konzentrationsbestimmung von Proteinen mittels Bicinchoninsäure (BCA-Assay)_111
4.4.5 Affinitätschromatographie von Zellkulturüberständen_111
4.4.6 ELISA ähnliche Bindungsstudien_____113
4.4.7 Oberflächen Plasmon Resonanz Spektroskopie (SPR)_114
4.5 Homologiemodelling_____116
4.6 Histologische und Immunhistochemische Methoden_116
4.6.1 Gewebepräparation für Gefrierschnitte___116
4.6.2 Kompetitionsexperimente auf Gefrierschnitten_116
4.6.3 Indirekte Immunfluoreszenz Färbung von Gefrierschnitten_117
4.6.4 Hämatoxylin-Eosin Färbung (H E)___117
4.6.5 Fluoreszenz und Lichtmikroskopie___118
5 Abkürzungsverzeichnis___119
6 Literatur________121
7 Danksagung___133
8 Anhang________334
Erklärung________139
Lebenslauf______ 140
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