Assemblierung von Kollagen-VI-Ketten und Kollagen-VI-defiziente Mäuse als Modell für Hautphänotypen bei Kollagen-VI-abhängigen Myopathien:
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| adam_text | Titel: Assemblierung von Kollagen-VI-Ketten und Kollagen-VI-defiziente Mäuse als Modell für Hautphänotyp
Autor: Lettmann, Sandra
Jahr: 2014
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis...................................................................................................IV
Zusammenfassung......................................................................................................VIII
Abstract........................................................................................................................IX
1 Einleitung..................................................................................................................1
1.1 Kollagene............................................................................................................1
1.2 Kollagen VI..........................................................................................................2
1.2.1 Domänenstruktur von Kollagen VI....................................................................3
1.2.2 Kollagen VI Assemblierung.............................................................................4
1.2.3 Bindungspartner von Kollagen VI....................................................................6
1.2.4 Mutationen in Kollagen VI Genen führen zu Muskelerkrankungen.......................7
1.3 Kollagen VI im Mausmodell...................................................................................9
1.4 Das Organ Haut.................................................................................................11
1.4.1 Aufbau.......................................................................................................11
1.4.2 Wundheilung...............................................................................................11
1.5 Zielsetzung........................................................................................................14
2. Material und Methoden............................................................................................15
2.1 Material............................................................................................................15
2.1.1 Verwendete Chemikalien..............................................................................15
2.1.2 Puffer.........................................................................................................17
2.1.3 Enzyme......................................................................................................19
2.1.4 DNA-Längenstandards und Protein-Molekulargewichtsstandard........................19
2.1.5 Primäre Antikörper......................................................................................19
2.1.6 Sekundäre Antikörper..................................................................................20
2.1.7 Oligonukleotide und Vektoren.......................................................................20
2.2 Methoden..........................................................................................................23
2.2.1 Immunhistochemie......................................................................................23
2.2.1.1 Gewebeschnitte....................................................................................23
2.2.1.2 Immunofluoreszenzfärbung von Gewebeschnitten.....................................23
2.2.1.3 Immunofluoreszenzfärbung von Zellen....................................................23
2.2.1.4 Hematoxylin/Eosin Färbung....................................................................23
2.2.1.5 Fast Green/Picrosirius Rot Färbung.........................................................24
2.2.2 Biochemische Methoden..............................................................................24
2.2.2.1 Sequentielle Proteinextraktion aus Haut und Wunde.................................24
2.2.2.2 Dialyse.................................................................................................24
2.2.2.3 Proteinfällung.......................................................................................24
2.2.2.4 Einschritt Proteinextraktion unter reduzierenden Bedingungen..................25
2.2.2.5 SDS-PAGE...........................................................................................25
2.2.2.6 Coomassie Färbung von Proteinen..........................................................25
2.2.2.7 Western Blot (Immunoblot)....................................................................25
2.2.2.7.1 Genotypisierung mittels Immunoblot....................................................26
2.2.2.8 Co-Färbung des Immunoblots mittels Odyssey-System..............................26
2.2.2.9 Agarose-Polyacrylamid Gele...................................................................26
2.2.3 Molekularbiologische Methoden....................................................................27
2.2.3.1 RNA Isolation und cDNA Synthese.........................................................27
2.2.3.2 PCR.....................................................................................................27
2.2.3.2.1 Genotypisierung mittels PCR...............................................................27
2.2.3.3 Mutagenese..........................................................................................28
2.2.3.4 Agarosegelelektrophorese.......................................................................28
2.2.3.5 Isolierung von DNA aus Agarosegelen......................................................29
2.2.3.6 Restriktionsverdau von DNA...................................................................29
2.2.3.7 Ligation...............................................................................................29
2.2.3.8 Sequenzierung von DNA........................................................................29
2.2.3.9 Transformation von Bakterien.................................................................29
2.2.3.10 DNA Reinigung aus Bakterienkulturen..................................................29
2.2.4 Zellkulturarbeiten........................................................................................30
2.2.4.1 Verwendete Zellen und Zelllinien............................................................30
2.2.4.2 Expansion von Zellen.............................................................................30
2.2.4.3 Kryokonservierung von Zellen.................................................................30
2.2.4.4 Transfektion von Zellen.........................................................................31
2.2.4.5 Herstellung des Zelllysates.....................................................................31
2.2.4.6 Herstellung einer organotypischen 3D-Kultur...........................................31
2.2.4.7 Lysieren von 3D-Kulturen......................................................................32
2.2.5 Versuchstierarbeiten....................................................................................32
2.2.5.1 Verwendete Tiere..................................................................................33
2.2.5.2 Verwundung.........................................................................................33
2.2.5.3 Bleomycin Behandlung..........................................................................33
2.2.6 Auswertungsprogramme...............................................................................33
2.2.7 Statistik.....................................................................................................34
3. Ergebnisse..............................................................................................................35
3.1 Analyse der Assemblierung der neuen Kollagen VI a Ketten................................35
3.1.1 Untersuchung verschiedener Zellkultursysteme...............................................35
3.1.1.1 RT-PCR Screening................................................................................35
3.1.1.2 Expression der neuen Ketten in Zellkulturen............................................36
3.1.2 Transfektion von SaOS2 Zellen mit humaner Kollagen VI a5 Kette kodierendem
Konstrukt............................................................................................................41
3.1.3 Untersuchung von Kollagen VI o5 und a6 Ketten exprimierenden Geweben......44
3.2 Kollagen VI al defiziente Mäuse als Modell für Hautphänotypen bei Kollagen VI
abhängigen Myopathien............................................................................................48
3.2.1 Untersuchung der Haut von Col6aIv Mäusen.................................................49
3.2.2 Morphologie der Wunden in der Haut von Col6al A Mäusen.............................49
3.2.3 Analyse der Kollagen VI Ketten während der Wundheilung...............................51
3.2.4 Degradation der Kollagen VI a3 Kette............................................................60
3.2.5 Untersuchung von Wundheilungsparametern und Kollagen VI Bindungspartnern 62
3.2.6 Analyse der Kollagenfibrillen im Wundgewebe von ColôalMäusen.................62
4 Diskussion...............................................................................................................68
4.1 Assemblierung der neuen Kollagen VI Ketten........................................................68
4.2 Kollagen VI defiziente Mäuse als Modell für Hautphänotypen bei Kollagen VI
abhängigen Myopathien............................................................................................71
4.3 Ausblick............................................................................................................76
5 Literaturverzeichnis..................................................................................................77
Danksagung................................................................................................................85
Erklärung....................................................................................................................87
Lebenslauf..................................................................................................................88
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