Der Sodium-dependent Organic Anion Transporter SOAT: Gewebeexpression, vergleichende funktionelle Charakterisierung und Generierung einer 3D-QSAR Pharmakophore:
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| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
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Gießen, Lahn
VVB Laufersweiler Verlag
2013
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN V
VERZEICHNIS DER TABELLEN VIII
ABKUERZUNGEN IX
DARSTELLUNG DER ALLGEMEINEN GALLENSAEURE- BZW. STEROIDSTRUKTUR XII
EIN- UND DREIBUCHSTABENCODE DER AMINOSAEUREN XIII
DER GENETISCHE CODE XIII
VORSAETZE IM DEZIMALSYSTEM XIII
1 EINLEITUNG 1
1.1 MEMBRANTRANSPORT 1
1.2 DIE SLC10- FAMILIE 3
1.3 DAS NAVTAUROCHOLAT COTRANSPORTING POLYPEPTIDE (NTCP, SLC10A1) 5
1.3.1 SUBSTRATSPEKTMM UND TRANSPORTEIGENSCHAFTEN 5
1.3.2 GEWEBEEXPRESSION UND FUNKTION 5
1.3.3 PHARMAKOLOGISCHE BEDEUTUNG DES NTCP/NTCP 6
1.4 DER APICAL SODIUM-DEPENDENT BILE ACID TRANSPORTER (ASBT, SLC10A2) 7
1.4.1 SUBSTRATSPEKTRUM UND TRANSPORTEIGENSCHAFTEN 7
1.4.2 GEWEBEEXPRESSION UND FUNKTION 7
1.4.3 PHARMAKOLOGISCHE BEDEUTUNG DES ASBT/ASBT 9
1.5 DER ENTEROHEPATISCHE KREISLAUF 10
1.6 DER SODIUM-DEPENDENT ORGANIC ANION TRANSPORTER (SOAT, SLC10A6) 13 *
1.6.1 SUBSTRATSPEKTRUM UND TRANSPORTEIGENSCHAFTEN DES SOAT 13
1.6.2 GEWEBEEXPRESSION UND MOEGLICHE FUNKTION 13
1.6.3 STEROIDSULFATE UND DEREN ENZYMATISCHE UMWANDLUNG 14
1.7 WEITERE MITGLIEDER DER SLC10-FAMILIE 15
1.7.1 SLC10A3 15
1.7.2 SLC10A4 15
1.7.3 SLC10A5 16
1.7.4 SLC10A7 16
1.8 ZIELSETZUNG 17
2 MATERIAL 18
2.1 MATERIALIEN FUER DIE MOLEKULARBIOLOGIE 18
2.1.1 PRIMER 18
2.1.2 ENZYME 18
2.1.3 VEKTOREN 19
2.1.4 BAKTERIENSTAMME 21
2.1.5 QPCR 21
2.1.6 KOMMERZIELL ERHALTLICHE KITS UND MATERIALIEN 22
2.1.7 PUFFER UND MEDIEN 23
2.2 AGAROSE-GELELEKTROPHORESEN 23
2.2.1 NATIVE AGAROSE-GELELEKTROPHORESE (DNA) 23
2.2.2 DENATURIERENDE AGAROSE-GELELEKTROPHORESE (RNA) 24
2.2.3 LAENGENSTANDARDS 24
2.3 ZELLKULTUR 25
2.3.1 ZELLLINIEN 25
2.3.2 ZELLKULTURMEDIEN 25
2.3.3 ANTIBIOTIKA 26
2.4 TRANSPORTMESSUNGEN AN EUKARYOTISCHEN ZELLEN 26
2.4.1 PUFFER UND LOESUNGEN 26
2.4.2 PROTEINBESTIMMUNG 26
I
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
2.5 DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE 27
2.6 ANTIKOERPER UND FLUORESZENZFARBSTOFFE 27
2.7 IMMUNFLUORESZENZ 28
2.7.1 PUFFER UND LOESUNGEN FUER IMMUNFLUORESZENZ AN EUKARYOTISCHEN ZELLEN
28 2.8 IMMUNHISTOCHEMIE 28
2.8.1 MATERIAL, PUFFER UND LOESUNGEN FUER DIE IMMUNHISTOCHEMIE 29
2.9 PROTEINANALYSE 30
2.9.1 TRIS-GLYCIN-SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (PROTEINE) 30
2.9.2 PUFFER UND LOESUNGEN FUER WESTERN BLOT 30
2.9.3 FILMENTWICKLUNG 31
2.9.4 KOMMERZIELL ERHAELTLICHE KITS 31
2.9.5 LAENGENSTANDARDS 31
2.10 CHEMISCHE SUBSTANZEN 32
2.10.1 REAGENZIEN 32
2.10.2 FEINCHEMIKALIEN 34
2.10.3 RADIOAKTIV-MARKIERTE SUBSTANZEN 36
2.11 GERAETE 37
2.12 VERBRAUCHSMATERIAL 38
2.13 BIOINFORMATISCHE PROGRAMME UND DATENBANKEN 39
3 METHODEN 42
3.1 ALLGEMEINE METHODEN IN DER MOLEKULARBIOLOGIE 42
3.1.1 DNA- UND RNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 42
3.1.2 NATIVE AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 42
3.1.3 AUFREINIGUNG VON PCR-AMPLIFIKATEN 43
3.1.4 AUFREINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 43
3.1.5 RESTRIKTIONSENZYMATISCHE SPALTUNG VON DNA 43
3.1.6 AUFREINIGUNG VON PLASMID-DNA IM MINI-MASSSTAB 44
3.1.7 PLASMID-PRAEPARATIONEN IM MIDI-MASSSTAB 44
3.2 ISOLIERUNG UND AUFARBEITUNG VON RNA 45
3.2.1 MAEUSE UND ORGANENTNAHME 45
3.2.2 ISOLIERUNG VON TOTAL-RNA AUS GEWEBEN 45
3.2.3 ISOLIERUNG VON TOTAL-RNA AUS ZELLEN 46
3.2.4 AUFREINIGUNG VON POLYA*-RNA AUS TOTAL-RNA 47
3.2.5 DENATURIERENDE AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 47
3.2.6 DNASE VERDAU 48
3.2.7 CDNA-SYNTHESE AUS TOTAL- UND POLY A*-RNA 49
3.2.8 LASER-ASSISTED CELL PICKING (LACP) UND EXTRAKTION VON RNA 49
3.3 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 51
3.3.1 ALLGEMEINE REGELN ZUR PRIMERAUSWAHL 51
3.3.2 PCR-REAKTIONSANSATZ 52
3.3.3 TOUCHDOWN-PCR 53
3.3.4 NESTED-PCR 53
3.3.5 RACE-PCR 53
3.3.6 QUANTITATIVE REAL-TIME PCR 54
3.4 DNA-KLONIERUNG 56
3.4.1 TOPO-KLONIERUNG 56
3.4.2 TRANSFORMATION 56
3.4.3 DIE TETRAZYKLIN-REGULIERTE PROTEINEXPRESSION 57
3.5 SEQUENZIERUNG UND AUSWERTUNG DER SEQUENZSPUREN 57
3.6 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 58
3.6.1 PASSAGIEREN UND AUSSAEEN DER ZELLEN 58
3.6.2 EINFRIEREN DER ZELLEN 58
3.6.3 AUFTAUEN DER ZELLEN 58
3.7 TRANSPORTMESSUNG AN HEK293-ZELLEN 59
3.7.1 VERSUCHSVORBEREITUNG 59
3.7.2 TRANSPORTMESSUNG 59
3.7.3 C/S-HEMMUNG UND ERMITTLUNG DER IC 50 -WERTE 60
3.7.4 FLUESSIGSZINTILLATIONSMESSUNG 60
3.7.5 PROTEINBESTIMMUNG 61
II
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
3.7.6 AUSWERTUNG DER AUFNAHMEVERSUCHE 61
3.8 IMMUNFLUORESZENZ 61
3.8.1 HERSTELLUNG DES MSOAT 317J31- UND DES MSOATSM-JW-ANTIKOERPERS 62
3.8.2 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ MIT VERSCHIEDENEN MSOAT-ANTIKOERPERN 63
3.8.3 MIKROSKOPIE 64
3.9 IMMUNHISTOCHEMIE 64
3.9.1 HERSTELLUNG HISTOLOGISCHER SCHNITTE 65
3.9.2 IMMUNHISTOCHEMISCHE AUFBEREITUNG UND FAERBUNG 65
3.10 WESTERN BLOT 66
3.10.1 PROTEINAUFBEREITUNG 66
3.10.2 PROTEINBESTIMMUNG 67
3.10.3 GELLAUF UND BLOTTING 67
3.10.4 BLOCKIERUNG DER MEMBRAN UND ANTIKOERPERREAKTION 68
3.10.5 DETEKTION 68
3.11 DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE 69
4 ERGEBNISSE 71
4.1 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG DES MURINEN SOAT (MSOAT) 71
4.1.1 SEQUENZANALYSE DES MURINEN SOAT 71
4.1.2 MEMBRANEXPRESSION UND -TOPOLOGIE 73
4.1.3 EXPRESSION DES MSOAT UND DES ANDROGENREZEPTORS DER MAUS (MAR) 75
4.1.4 IMMUNHISTOCHEMISCHER NACHWEIS VON MSOAT IN GEWEBEN 79
4.1.5 ZEIT- UND NATRIUM-ABHAENGIGE AUFNAHME VON MSOAT-SUBSTRATEN 81
4.1.6 KINETISCHE BESTIMMUNG DES MSOAT- VERMITTELTEN TRANSPORTES 82
4.1.7 C/S-HEMMUNGEN DES MSOAT 85
4.2 DER SOAT DES SCHWEINS (SUSSOAT) 88
4.2.1 SEQUENZBESTIMMUNG DES SUSSOAT 88
4.2.2 QUANTITATIVE BESTIMMUNG DES SOAT IM HODEN DES SCHWEINS 90
4.3 SUBSTRATVERGLEICH DER SLC10-CARRIER NTCP, ASBT UND SOAT 92
4.3.1 UNTERSUCHUNG DER EXPRESSION AN STABIL TRANSFIZIERTEN ZELLLINIEN
DURCH QUANTITATIVE REAL-TIME PCR 92
4.3.2 SUBSTRATPROFIL VON NTCP, ASBT UND SOAT 93
4.3.3 KINETISCHE TRANSPORTBESTIMMUNGEN FUER NTCP, ASBT UND SOAT 99
4.3.4 KONTROLLE DER GALLENSAEUREN DURCH DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE 104
4.3.5 AUFNAHMEVERSUCHE MIT TAUROLITHOCHOLAT-3-SULFAT 106
4.4 GENERIERUNG EINES 3D-QSAR PHARMAKOPHORMODEILS FUER SOAT 110 4.4.1
BESTIMMUNG VON IC50- WERTEN 110
4.4.2 INITIALES SCREENING 111
4.4.3 ERSTELLEN DER SOAT-PHARMAKOPHORE 114
4.4.4 VALIDIERUNG DER SOAT-PHARMAKOPHORHYPOTHESE 118
4.4.5 VERGLEICH DER ICSO-WERTE DES TRAINING SET VON CASBT UND SOAT 120
4.4.6 STIMULIERENDE EFFEKTE 122
5 DISKUSSION 124
5.1 CHARAKTERISIERUNG DES MSOAT 124
5.1.1 SEQUENZANALYSE, MEMBRANTOPOLOGIE UND IN SILICO PROMOTORANALYSE VON
MSOAT UND SOAT IM VERGLEICH 124
5.1.2 TRANSPORTEIGENSCHAFTEN UND INHIBITORISCHES PROFIL VON MSOAT UND
SOAT IM VERGLEICH 126
5.1.3 EXPRESSION VON MSOAT UND SOAT 128
5.1.4 PHYSIOLOGISCHE BEDEUTUNG DES MSOAT/SOAT 129
5.2 DER SOAT DES SCHWEINS 132
5.2.1 VERWANDTSCHAFTSANALYSE DER SLC10A6-FAMILIENMITGLIEDER 132
5.2.2 DIE PHYSIOLOGISCHE ROLLE DES SUSSOAT 134
5.3 SUBSTRATVERGLEICH VON SOAT, NTCP UND ASBT 134
5.3.1 DAS SUBSTRATPROFIL VON SOAT, NTCP UND ASBT 135
5.3.2 FUNKTIONELLE GRUPPEN DER SUBSTRATERKENNUNG 137
5.4 VERGLEICH DER PHARMAKOPHORMODELLE UND DES INHIBITORISCHEN PROFILS
VON SOAT, ASBT UND NTCP 140
III
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
5.4.1 DIE BEDEUTUNG EINES PHARMAKOPHORMODELLS 140
5.4.2 DIE ROLLE UND ERSTELLUNG DES SOAT- PHARMAKOPHORMODELLS 141
5.4.3 VERGLEICH DER PHARMAKOPHOREN VON SOAT UND CASBT/ASBT 143
5.4.4 VERGLEICH DER PHARMAKOPHOREN VON SOAT UND NTCP BZW. NTCP UND ASBT
147 5.4.5 STIMULIERENDE EFFEKTE 148
6 ZUSAMMENFASSUNG 156
7 SUMMARY 157
8 LITERATURVERZEICHNIS 159
9 DANKSAGUNGEN 176
IV
|
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