Ein genetischer Ansatz zur Analyse der cAMP-abhängigen Modulation des Schrittmacherkanals HCN4:
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1. EINLEITUNG 9
1.1. STRUKTUR DER HCN KANAELE 9
1.2. DUALES GATING 12
1.3. PHYSIOLOGISCHE FUNKTIONEN DER HCN KANAELE 14
13.1. ROLLE DER HCN KANAELE FUER DIE PHYSIOLOGISCHE HERZFUNKTION 14
1.3.2. PHYSIOLOGISCHE FUNKTIONEN DER HCN KANAELE IM GEHIRN 15
1.4. MAUSMODELLE DES HCN4 KANALS 18
1.5. EIN NEUER GENETISCHER ANSATZ ZUR ANALYSE DER CAMP-ABHAENGIGEN
MODULATION
VON HCN4 20
2. ZIELSETZUNG DER ARBEIT 23
3. MATERIAL UND METHODEN 25
3.1. CHEMIKALIEN, LOESUNGEN UND PUFFERLOESUNGEN 25
3.2. ARBEITEN MIT DNA 25
3.2.1. AMPLIFIKATION UND ISOLATION VON PLASMIDEN 25
3.2.1.1. KULTIVIERUNG VON E. COLI BAKTERIEN 25
3.2.1.2. TRANSFORMATION VON E. COLI BAKTERIEN 26
3.2.1.3. PLASMIDPRAEPARATION (MINIPREP) 26
3.2.1.4. PLASMIDPRAEPARATION (MIDIPREP) 27
32.15. PLASMIDPRAEPARATION DES TARGETING VEKTORS FUER DIE ELEKTROPORATION
IN EMBRYONALE STAMMZELLEN 27
3.2.2. AUFTRENNUNG,
AUFREINIGUNG UND
ANALYSE VON DNA 27
3.2.2.1. AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 2 7
3.2.2.2. ISOLIERUNG VON DNA AUS AGAROSE-GELEN 28
3.2.2.3. PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION 28
3.2.2.4. FAELLUNG VON DNA 28
3.2.3. ENZYMATISCHE MODIFIKATION VON DNA 29
3.2.3.1. VERDAU
MIT RESTRIKTIONSENZYMEN 29
3.2.3.2. DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA 29
3.2.3.3. LIGATION VON DNA 29
3.23.4. GENERIERUNG VON HILFSVEKTOREN MIT MASSGESCHNEIDERTER POLYKLONIE-
RUNGSSTELLE 29
5
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3.2.4. ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA AUS
GEWEBE VON MAEUSEN 30
3.2.5. POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 30
3.2.6. QUANTIFIZIERUNG VON DNA 31
3.2.7. SEQUENZIERUNG VON DNA 31
3.3. GENTARGETING 32
3.3.1. ELEKTROPORATION 32
3.3.2. SELEKTION DER EMBRYONALEN STAMMZELLEN MIT G418 32
33.3. PICKEN DER EMBRYONALEN STAMMZELLEN 32
33.4. EINFRIEREN DER STAMMZELLEN 32
33.5. ISOLATION GENOMISCHER DNA 33
3.3.6. SOUTHERN BLOT ANALYSE 33
3 3.6.1. RESTRIKTIONSVERDAU 33
33.6.2. GELELEKTROPHORESE 34
3.3.6.3. BLOTTING 34
3.3.6.4. GENERIERUNG RADIOAKTIV MARKIERTER DNA-SONDEN 34
3.3.6.5. HYBRIDISIERUNG 35
3.4. ARBEITEN MIT RNA 36
3.4.1. ISOLIERUNG VON RNA AUS GEWEBE 36
3.4.2. CDNA SYNTHESE AUS
MRNA 37
3.43. PCR VON CDNA 37
ERGEBNISSE 39
4.1. AUSARBEITUNG EINER GENTARGETING STRATEGIE ZUR MUTATION DES HCN4
GENS 39
4.1.1. ACN KASSETTE 40
4.1.2. AUSARBEITUNG EINER SOUTHERN BLOT STRATEGIE ZUM NACHWEIS DER
HOMOLOGEN
REKOMBINATION 41
4.1.3. VERIFIZIERUNG DER SOUTHERN STRATEGIE MIT GENOMISCHER
DNA EINER WILDTYP
MAUS 42
4.2. KLONIERUNG DES TARGETING VEKTORS 43
4.2.1. HERSTELLUNG VON HILFSVEKTOREN 43
4.2.2. KLONIERUNG DES TARGETING VEKTORS 44
4.2.3. UEBERPRUEFUNG DES FERTIGEN TARGETING VEKTORS MITTELS
RESTRIKTIONSVERDAU
51
4.2.4. SEQUENZIERUNG DES FERTIGEN TARGETING VEKTORS 52
4.25. AUFREINIGUNG DES TARGETING VEKTORS 52
4.2.6. LINEARISIERUNG UND FAELLUNG DES TARGETING VEKTORS FUER DIE
ELEKTROPORATION
IN EMBRYONALE STAMMZELLEN 53
43. GENTARGETING 53
43.1. ELEKTROPORATION 53
43.2. SELEKTION DER EMBRYONALEN STAMMZELLEN MIT G418 53
433. PICKEN DER EMBRYONALEN STAMMZELLEN 54
4.3.4. EINFRIEREN DER STAMMZELLEN 54
43.5. ISOLATION GENOMISCHER DNA 54
4.4. ANALYSE DER VERAENDERTEN EMBRYONALEN STAMMZELLEN 54
4.4.1. SOUTHERN BLOT ANALYSE 54
4.4.2. SEQUENZIERUNG DER GENOMISCHEN DNA DER EMBRYONALEN STAMMZELLEN 57
45. INJEKTION DER EMBRYONALEN STAMMZELLEN 59
4.6. VERPAARUNG DER CHIMAEREN 60
4.7. ERNEUTES GENTARGETING ZUR GENERIERUNG DER HCN4FEA MAUSLINIE 60
4.8. EFFIZIENZ DES GENTARGETINGS 64
4.9. ANALYSE DER GENERIERTEN MAUSLINIEN 64
4.9.1. GENOTYPISIERUNGSSTRATEGIE 64
4.9.2. SEQUENZIERUNG GENOMISCHER DNA DER BEIDEN GENERIERTEN MAUSLINIEN
64
4.9.3. SOUTHERN BLOT DER HCN4Y527F MAUSLINIE 65
4.9.4. SOUTHERN BLOT DER FEA MAUSLINIE 66
4.9.5. SOUTHERN BLOT DER BEIDEN MAUSLINIEN MIT DER ACN NEO SONDE 66
4.9.6. NACHWEIS DES KORREKTEN SPLEISSENS UND DES VORHANDENSEINS DER MUTA
TIONEN AUFMRNA EBENE DURCH RT-PCR 68
4.9.7. GENERELLER PHAENOTYP DER HCN4Y527F MAUSLINIE 69
4.9.8. GENERELLER PHAENOTYP DER HCN4FEA MAUSLINIE 69
5. DISKUSSION 71
5.1. KLONIERUNG DES TARGETING VEKTORS UND GENTARGETING 71
5.2. ANALYSE DER HCN4FEA UND HCN4Y527F MAUSLINIEN 71
5.3. AUSBLICK 73
6. ZUSAMMENFASSUNG 77
7. LITERATURVERZEICHNIS 79
8. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 85
9. ANHANG 87
9.1. VERWENDETE PLASMIDE 87
7
9.2. VERWENDETE PRIMER 87
93. VERWENDETE MODIFIZIERTE OLIGONUKLEOTIDE 90
9.4. SEQUENZ DES TARGETING VEKTORS 91
10. LEBENSLAUF 97
11. PUBLIKATIONEN 99
8
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