Untersuchungen zur Relevanz der reversiblen Methylierung von Jasmonsäure in Solanum lycopersicum:
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2012
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1 ZUSAMMENFASSUNG/SUMMARY 1
2 EINLEITUNG 4
2.1 JASMONATE 4
2.2 JA-BIOSYNTHESE 5
2.2.1 METABOLISIERUNG VON JA 7
2.2.2 REVERSIBLE METHYLIERUNG VON JA 10
2.3 FUNKTION DER JASMONATE IN ENTWICKLUNG UND ABWEHRREAKTIONEN 13
2.3.1 INTERAKTION DER PHYTOHORMON-SIGNALWEGE 13
2.3.2 JASMONATE IN DER ENTWICKLUNG 15
2.3.3 JASMONATE IN DER WUNDANTWORT IN TOMATE 16
2.3.4 JASMONATE IN DER PATHOGENABWEHR: 20
2.4 SCLEROTINIA SCLEROTIORUM (LIB.) DE BARY 22
3 ZIELSETZUNG 25
4 MATERIALIEN 27
4.1.1 PFLANZENMATERIAL 27
4.1.2 ANTIBIOTIKA 27
4.1.3 CHEMIKALIEN 27
4.1.4 VERBRAUCHSMATERIAL 29
4.1.5 GERAETE 29
4.1.6 PHYTOHORMONE UND SYNTHETISCHE ANALOGA 30
4.1.7 PUFFER 30
4.1.8 MEDIEN: 31
4.1.9 ENZYME 33
4.1.10 PRIMER 34
4.1.11 VEKTOREN 36
5 METHODEN 38
5.1 ARBEITEN MIT BAKTERIEN 38
5.1.1 KULTIVIERUNG UND STAMMHALTUNG 38
5.1.1.1 KULTIVIERUNG VON E. COLI 38
5.1.1.2 KULTIVIERUNG VON A TUMEFACIENS 38
I
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5.1.2 HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN 38
5.1.2.1 HERSTELLUNG KOMPETENTER F. COLI 38
5.1.2.2 HERSTELLUNG KOMPETENTER A. TUMEFACIENS 39
5.1.3 TRANSFORMATION 39
5.1.3.1 TRANSFORMATION VON E. COLI 39
5.1.3.2 TRANSFORMATION VON A. TUMEFACIENS 40
5.1.4 MINIPRAEPARATION VON PLASMID-DNA 40
5.1.4.1 MINIPRAEPARATION VON PLASMID-DNA AUS E. COLI 40
5.1.4.2 MINIPRAEPARATION VON PLASMID-DNA AUS F. COLI MITTELS KIT 40
5.1.4.3 MINIPRAEPARATION VON PLASMID-DNA AUS A. TUMEFACIENS 41
5.1.5 COLONY SCREEN PCR 42
5.1.5.1 *COLONY SCREEN -PCR VON E. COLI 42
5.1.5.2 *COLONY SCREEN -PCR VON A. TUMEFACIENS 42
5.2 ARBEITEN MIT S. LYCOPERSICUM 43
5.2.1 OBERFLAECHENSTERILISATION DER SAMEN 43
5.2.2 PFLANZENANZUCHT 43
5.2.3 *LEAF DISC -TRANSFORMATION 43
5.2.4 SAMENGEWINNUNG 44
5.2.5 PFROPFUNG DURCH KOPULATION 45
5.3 ARBEITEN MIT S. SCLEROTIORUM 46
5.3.1 KULTIVIERUNG 46
5.3.2 GEWINNUNG INFEKTIOESER HYPHEN 46
5.3.3 INOKULATION VON S. LYCOPERSICUM 46
5.4 DNA-TECHNISCHE METHODEN 47
5.4.1 QUANTIFIZIERUNG VON DNA 47
5.4.2 DNA-ISOLIERUNG AUS BLATTMATERIAL 47
5.4.3 PCR 48
5.4.4 AUFREINIGUNG VON PCR PRODUKTEN 49
5.4.5 RESTRIKTIONSVERDAU 49
5.4.6 DEPHOSPHORYLIERUNG 50
5.4.7 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 50
5.4.8 EXTRAKTION VON DNA FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 51
U
5.4.9 LIGATION 51
5.5 RNA-TECHNISCHE METHODEN 52
5.5.1 QUANTIFIZIERUNG VON RNA 52
5.5.2 RNA-ISOLATION AUS BLATTMATERIAL 52
5.5.3 DENATURIERENDE RNA-GELELEKTROPHORESE 52
5.5.4 ONASE-VERDAU 53
5.5.5 CDNA-SYNTHESE 53
5.5.6 QPCR 54
5.6 PROTEIN-TECHNISCHE METHODEN 56
5.6.1 HERSTELLUNG DES PROTEINROHEXTRAKTES 56
5.6.2 PROTEINGEHALTSBESTIMMUNG NACH BRADFORD 56
5.6.3 BESTIMMUNG DER MJE-PROTEINAKTIVITAET 56
5.7 ANALYTIK 57
5.7.1 EXTRAKTION VON PHYTOHORMONEN (VERWUNDUNGSEXPERIMENTE) 57
5.7.2 EXTRAKTION VON JA, JA-ILE,
OPDA, 12-OH-JA-LLE (PATHOGENEXPERIMENTE)... 58
5.7.3 QUANTIFIZIERUNG DER ANALYTEN MITTELS UPLC-Q-TOF 58
5.8 LUMINESZENZMESSUNGEN 60
6 ERGEBNISSE 61
6.1 GENERIERUNG TRANSGENER LINIEN 61
6.2 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG TRANSGENER LINIEN AUF RNA-EBENE 62
6.2.1 CHARAKTERISIERUNG DER MJE-OE-LINIEN 63
6.2.2 CHARAKTERISIERUNG DER MJE-RNAI-LINIEN 64
6.2.3 CHARAKTERISIERUNG DER JMT-OE-LINIEN 65
6.3 BESTIMMUNG DER MJE-HYDROLYSEAKTIVITAET 66
6.3.1 MJE-OE-LINIEN 67
6.3.2 MJE-RNAI-LINIEN 68
6.4 HABITUS DER TRANSGENEN LINIEN 69
6.5 UNTERSUCHUNG DER KEIMUNGSRATE 70
6.6 MEJA-APPLIKATIONSVERSUCHE 71
6.7 ETABLIERUNG EINES VERWUNDUNGS-TESTSYSTEMS 76
6.8 LOKALE VERWUNDUNGSANTWORT 79
6.8.1 GENEXPRESSION NACH VERWUNDUNG 79
III
6.8.1.1 GENEXPRESSIONSANALYSE DER MJE-OE-LINIEN 80
6.8.1.2 GENEXPRESSIONSANALYSE DER MJE-RNAI-LINIEN 81
6.8.1.3 GENEXPRESSIONSANALYSE DER JMT-OE-LINIEN 82
6.8.2 OXYLIPINPROFIL NACH VERWUNDUNG 83
6.8.2.1 OXYLIPINPROFIL DER MJE-OE-LINIEN NACH VERWUNDUNG 83
6.8.2.2 OXYLIPINPROFIL DER MJE-RNAI-LINIEN NACH VERWUNDUNG 85
6.8.2.3 OXYLIPINPROFIL DER JMT-OE-LINIEN NACH
VERWUNDUNG 87
6.8.3 SA-AKKUMULATION NACH VERWUNDUNG 88
6.8.3.1 SA-AKKUMULATION IN MJE-OE-LINIEN 88
6.8.3.2 SA-AKKUMULATION IN MJE-RNAI-LINIEN 89
6.8.3.3 SA-AKKUMULATION IN JMT-OE-LINIEN 90
6.9 DISTALE VERWUNDUNGSREAKTION 91
6.10 EINFLUSS DER REVERSIBLEN METHYLIERUNG AUF DIE PATHOGENRESISTENZ
GEGENUEBER S.
SCLEROTIORUM 93
6.10.1 MJE-OE-LINIEN...-. 94
6.10.1.1 LAESIONEN 94
6.10.1.2 ANALYSE DES PATHOGENWACHSTUMS: 95
6.10.1.3 GENEXPRESSIONSANALYSE VON AOC UND PINII 96
6.10.1.4 OXYLIPIPROFI! 98
6.10.2 MJE-RNAI-LINIEN 100
6.10.2.1 LAESIONEN 100
6.10.2.2 ANALYSE DES PATHOGENWACHSTUMS 101
6.10.2.3 GENEXPRESSION VON AOC UND
PINII 102
6.10.2.4 OXYLIPINPROFIL 104
6.10.3 JMT-OE-LINIEN 106
6.10.3.1 LAESIONEN 106
6.10.3.2 ANALYSE DES PATHOGENWACHSTUMS 107
6.10.3.3 GENEXPRESSION VON AOC
UND PINII 108
6.10.3.4 OXYLIPINPROFIL 109
6.10.4 BEDEUTUNG DES JA-BIOSYNTHESEWEGES 111
6.11 ETABLIERUNG EINES IN VIVO REPORTERSYSTEMS 113
IV
6.11.1 IN VIVO AUSBREITUNG DES SYSTEMISCHEN SIGNALS
IN S. LYCOPERSICUM NACH
VERWUNDUNG 115
7 DISKUSSION 118
7.1 IST DIE MJE DIE EINZIGE, SPEZIFISCHE MEJA ESTERASE? 119
7.2 EINFLUSS DER MODIFIZIERUNG DER REVERSIBLEN METHYLIERUNG AUF DEN
PHAENOTYP... 120
7.2.1 EINFLUSS AUF DAS VEGETATIVE WACHSTUM 120
7.2.2 EINFLUSS AUF DIE KEIMUNGSRATE 121
7.3 BIOLOGISCHE AKTIVITAET VON MEJA 122
7.4 DIE RELEVANZ VON MEJA ALS PARAKRINES ODER SYSTEMISCHES SIGNAL DER
VERWUNDUNG 125
7.5 BEDEUTUNG DER REVERSIBLEN METHYLIERUNG FUER DIE PATHOGENRESISTENZ
GEGENUEBER S. SCLEROTIORUM 134
8 ZUSAMMENFASSUNG UND
AUSBLICK 140
9 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 143
9.1 GLOSSAR 146
10 LITERATURVERZEICHNIS 147
11 ANHANG 166
11.1 BESTIMMUNG DER MJE-HYDROLYSEAKTIVITAET TRANSGENER LINIEN 166
11.1.1 MJE-OE-LINIEN 166
11.1.2 MJE-RNAI-LINIEN 167
11.2 VERWUNDUNG LOKAL 168
11.2.1 MJE-OE-LINIEN 168
11.2.1.1 AOC-EXPRESSION 168
11.2.1.2 PINII-
EXPRESSION 169
11.2.1.3 JA-SPIEGEL 170
11.2.1.4 JA-ILE-SPIEGEL 171
11.2.1.5 12-OH-JA-LLE-SPIEGEL 172
11.2.1.6 OPDA-SPIEGEL 173
11.2.1.7 SA-SPIEGEL 174
11.2.2 MJE-RNAI-LINIEN 175
11.2.2.1 AOC-EXPRESSION 175
11.2.2.2 P/A///-EXPRESSION 176
V
11.2.2.3 JA-SPIEGEL 177
11.2.2.4 JA-ILE-SPIEGEL 178
11.2.2.5 12-OH-JA-LLE-SPIEGEL 179
11.2.2.6 OPDA-SPIEGEL 180
11.2.2.7 SA-SPIEGEL 181
11.2.3 JMT-OE-LINIEN 182
11.2.3.1 AOC-EXPRESSION 182
11.2.3.2 PINII-
EXPRESSION 182
11.2.3.3 JA-SPIEGEL 183
11.2.3.4 JA-ILE-SPIEGEL 183
11.3 PFROPFUNGSEXPERIMENTE 184
11.3.1 AOC-EXPRESSION 184
11.3.2 P/A/M-EXPRESSION 185
11.4 PATHOGENEXPERIMENTE MIT S. SCLEROTIORUM 186
11.4.1 AOC-EXPRESSION DER MJE-OE-LINIEN 186
11.4.2 AOC-EXPRESSION DER MJE-RNAI-LINIEN 187
11.4.3 AOC-EXPRESSION DER JMT-OE-LINIEN 188
11.4.4 PINII-EXPRESSION DER MJE-OE-LINIEN 189
11.4.5 P/N//-EXPRESSION DER MJE-RNAI-LINIEN 190
11.4.6 PINII-EXPRESSION DER JMT-OE-LINIEN 191
11.4.7 EXPRESSION DES FUGALEN AKTINS IN MJE-OE-LINIEN 192
11.4.8 EXPRESSION DES FUGALEN AKTINS IN MJE-RNAI-LINIEN 193
11.4.9 EXPRESSION DES FUNGALEN AKTINS IN JMT-OE-LINIEN 194
11.4.10 LAESIONSGROESSEN DER MJE-OE-LINIEN 195
11.4.11 LAESIONSGROESSEN DER MJE-RNAI-LINIEN 196
11.4.12 LAESIONSGROESSEN DER JMT-OE-LINIEN 197
11.4.13 JA-ILE-AKKUMULATION DER MJE-OE-LINIEN 198
11.4.14 JA-ILE AKKUMULATION DER MJE-RNAI-LINIEN 199
11.4.15 JA-ILE-AKKUMULATION DER JMT-OE-LINIEN 200
11.4.16 12-OH-JA-LLE-AKKUMULATION DER MJE-OE-LINEN 201
11.4.17 12-OH-JA-LLE-AKKUMULATION DER MJE-RNAI-LINIEN 202
11.4.18 OPDA-SPIEGEL DER MJE-OE-LINIEN 203
VI
11.4.19 OPDA-SPIEGEL DER MJE-RNAI-LINIEN 204
11.4.20 OPDA-SPIEGEL DER JMT-OE-LINIEN 205
11.4.21 SA-AKKUMULATION IN MJE-OE-LINIEN 205
12 DANKSAGUNG 206
13 EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG 208
VII
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