Charakterisierung der peroxisomalen AAA-Proteine PEX1 und PEX6 sowie Analysen zur zellulären Funktion von PEX6:
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|---|---|
| adam_text | GLIEDERUNG I
1. EINLEITUNG 1
1.1. PEROXISOMEN 1
1.2. ERKRANKUNGEN, DIE AUF PEROXISOMALEN DEFEKTEN BERUHEN 2
1.2.1. DAS ZELLWEGER-SPEKTRUM 2
1.2.2. PEROXISOMALE BIOGENESE-STOERUNGEN 3
1.2.3. PEROXISOMALE EINZEL-ENZYMDEFEKTE 5
1.3. DIE PEROXISOMALE BIOGENESE 5
1.3.1. BILDUNG DER PEROXISOMALEN MEMBRAN 5
1.3.2. INSERTION PEROXISOMALER MEMBRANPROTEINE 6
1.3.3. IMPORT PEROXISOMALER MATRIXPROTEINE 7
1.3.4. TEILUNG VON PEROXISOMEN 9
1.4. INSERTION UND EXPORT VON PEX5 AN DER PEROXISOMALEN MEMBRAN 9
1.5. DIE BEDEUTUNG DER PEROXISOMALEN AAA-PROTEINE 11
1.5.1. DAS PEROXIN PEX1 11
1.5.2. DAS PEROXIN PEX6 12
1.6. ZIELSETZUNG DER ARBEIT 13
2. MATERIAL UND METHODEN 16
2.1. GERAETE 16
2.2. CHEMIKALIEN UND KITS 16
2.3. LOESUNGEN, PUFFER UND MEDIEN 17
2.4. VERWENDETE ORGANISMEN 17
2.4.1. BAKTERIENSTAEMME 17
2.4.2. HEFESTAEMME 18
2.4.3. HUMANE ZELLLINIEN 18
2.5. VEKTOREN UND PLASMIDE 19
2.6. OLIGONUKLEOTIDE 20
2.7. ANTISEREN 23
2.8. KULTIVIERUNG HUMANER ZELLEN 24
2.8.1. ZELLKULTURMEDIEN UND LOESUNGEN 24
2.8.2. AUFTAUEN HUMANER ZELLEN 24
2.8.3. KULTIVIERUNG UND PASSAGIERUNG 25
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GLIEDERUNG II
2.8.4. EINFRIEREN EUKARYOTISCHER ZELLEN 25
2.9. TRANSFEKTION HUMANER ZELLEN MIT JET-PEI 25
2.10. IMMUNOFLUORESZENZ-ANFAERBUNG UND MIKROSKOPIE VON HUMANEN ZELLEN 26
2.11. DER *MAMMALIAN TWO-HYBRID -VERSUCH 26
2.12. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 27
2.12.1. HERSTELLUNG ELEKTROKOMPETENTER BAKTERIEN 27
2.12.2. TRANSFORMATION ELEKTROKOMPETENTER BAKTERIEN 27
2.12.3. POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 28
2.12.4. OLIGONUKLEOTID-HYBRIDISIERUNGSREAKTION 28
2.12.5. *SITE-DIRECTED MUTAGENESIS 29
2.12.6. RESTRIKTION VON DNA 29
2.12.7. AGAROSEGELELEKTROPHORESE 30
2.12.8. DNA-EXTRAKTION AUS AGAROSEGELEN 30
2.12.9. LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 30
2.12.10. BLAU-WEISS-SELEKTION 30
2.12.11. PLASMIDISOLATION 31
2.12.12. KONZENTRATIONS- UND REINHEITSBESTIMMUNG VON DNA 31
2.12.13. SEQUENZIERUNG 32
2.13. PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 32
2.13.1. HERSTELLUNG VON PROTEINPROBEN AUS HUMANEN ZELLEN 32
2.13.2. PROTEINBESTIMMUNG MITTELS BCA-TEST 32
2.13.3. PROTEINBESTIMMUNG MITTELS COOMASSIE (BRADFORD) 33
2.13.4. SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 33
2.13.5. SILBERFAERBUNG VON SDS-PAGE-GELEN 33
2.13.6. *WESTERN BLOT 34
2.13.7. IMMUNODETEKTION 34
2.13.8. ANTIKOERPERENTFERNUNG VON DER MEMBRAN 34
2.13.9. TRANSKRIPTION UND TRANSLATION (TNT) 35
2.13.10. KOIMMUNOPRAEZIPITATION 35
2.14. METHODEN ZUM HEFE-*TWO-HYBRID -VERSUCH 36
2.14.1. KULTUR- UND SELEKTIONSMEDIEN 36
2.14.2. FLUESSIG-, PLATTEN- UND DAUERKULTUREN VON HEFEN 37
2.14.3. ERSTELLUNG VON WACHSTUMSKURVEN 37
2.14.4. TRANSFORMATION VON HEFEN 37
2.14.5. PLASMIDISOLATION AUS HEFEZELLEN 38
GLIEDERUNG III
2.14.6. HEFEZELIAUFSCHLUSS DURCH CHEMISCHE LYSE (CL) 38
2.14.7. VERPAARUNG (*MATING ) VON HEFEZELLEN 38
2.14.8. A-GALAKTOSIDASE-TEST 39
2.14.9. PLASMIDAMPLIFIKATION IN KC8-ZELLEN 39
2.14.10. KOIMMUNOPRAEZIPITATION AUS HEFEN 40
2.14.11. KOVALENTE BINDUNG VON ANTIKOERPERN AN *BEADS 41
2.1
S. VIRALE TRANSDUKTION EUKARYOTISCHER ZELLEN NACH NOLAN 41
2.16. KOMPLEXISOLATION AUS HUMANEN ZELLEN 42
2.16.1. KOMPLEXISOLATION MIT DIGITONIN 43
2.16.2. KOMPLEXISOLATION NACH DER *TANDERN AFFINITY
PURIFICATION -METHODE 43
2.17. GELFILTRATION 45
2.18. MASSENSPEKTROMETRIE 45
2.18.1. DIE PROBENVORBEREITUNG 45
2.18.2. DIE MASSENSPEKTROMETRIE 45
2.18.3. DIE ANALYSE DER SPEKTROMETRISCHEN DATEN 46
2.19. BIOINFORMATISCHE METHODEN 46
2.19.1. DATENBANKEN 46
2.19.2. BIOINFORMATISCHE ANWENDUNGEN (*TOOLS AND SOFTWARE ) 47
3. ERGEBNISSE 48
3.1. DIE INTERAKTIONEN VON PEX1, PEX6 UND PEX26 48
3.2. INTERAKTIONEN VON PEROXINEN IM *MAMMALIAN TWO-HYBRID -SYSTEM 48
3.3. DIE PEX1, PEX6 UND PEX26 INTERAKTIONEN IM KERNLOKALISATIONSVERSUCH
50
3.3.1. ANALYSE DES ZUSAMMENSPIELS VON PEX6 UND PEX26 52
3.3.2. CHARAKTERISIERUNG DER INTERAKTION VON PEX1 UND PEX6 53
3.3.3. QUANTITATIVE ANALYSE DER PEX1 -PEX6-LNTERAKTION 56
3.3.4. FUNKTION DER PEX6-WALKERMOTIVE FUER DIE INTERAKTION MIT PEX26 58
3.4. FUNKTION DER PEX1- UND PEX6-WALKERMOTIVE FUER DEN IMPORT 61
3.4.1. BEDEUTUNG DER PEX1-WALKERMOTIVE FUER DEN YFP-PTS2-MATRIXIMPORT 61
3.4.2. PTS1
-GFP-IMPORT IST ABHAENGIG VON PEX1 -WALKERMOTIVEN 62
3.4.3. KATALASE-IMPORT WIRD DURCH PEX1 -WALKERMOTIVE BEEINFLUSST 64
3.4.4. YFP-PTS2-MATRIXIMPORT WIRD DURCH PEX6-WALKERMOTIVE VERRINGERT 65
3.4.5. BEDEUTUNG DER PEX6-WALKERMOTIVE FUER DEN PTS1 -GFP-MATRIXIMPORT 67
3.4.6. KATALASE-IMPORT BEI EXPRESSION VON PEX6-WALKERMOTIV-VARIANTEN 68
GLIEDERUNG IV
3.5. GIBT ES EINE INTERAKTION ZWISCHEN PEX5 UND PEX6? 70
3.5.1. PEX5-VARIANTEN FUER DEN KERNLOKALISATIONSVERSUCH MIT PEX6 71
3.5.2. INTERAKTIONSANALYSE DER PEX5-VARIANTEN UND PEX6 71
3.5.3. WIRD PEX5 UBIQUITINYLIERT UND ERFOLGT EINE INTERAKTION MIT PEX6?
73
3.5.4. EXPRESSION UND KOMPLEMENTATION DER PEX5-LYSIN-VARIANTEN 73
3.5.5. KERNLOKALISATIONSVERSUCHE DER PEX5-LYSIN-VARIANTEN MIT PEX6 75
3.6. PEX6-HEFE- TWO-HYBRID -ANALYSE 77
3.6.1. PLANUNG DER PEX6-HEFE- TWO-HYBRID -ANALYSE 77
3.6.2. EXPRESSION VON PEX6 IN DEM HEFESTAMM AH109 79
3.6.3. DURCHFUEHRUNG DES PEX6-*TWO-HYBRID SCREENS 81
3.6.4. VERPAARUNG (*MATING ) DER HEFESTAEMME AH109 UND Y187 82
3.6.5. SELEKTION DER VERPAARTEN HEFEZELLEN 83
3.6.6. VERIFIZIERUNG DER 370 DIPLOIDEN HEFE KLONE 84
3.6.7. PCR- UND RESTRIKTIONSANALYSE DER 178 POSITIVEN KLONE 85
3.6.8. INTERAKTIONSBESTAETIGUNG DURCH RUECKTRANSFORMATION IN AH109 86
3.7. ANALYSE DER INTERAKTIONSPARTNER AUS DEM PEX6-*TWO-HYBRID -VERSUCH
88
3.7.1. UNTERSUCHUNG DER ANALYSIERTEN PROTEINE 91
3.8. UEBERPRUEFUNG DER ERGEBNISSE AUS DEM HEFE-*TWO-HYBRID -VERSUCH 94
3.8.1. EXPRESSION DER MIT PEX6 INTERAGIERENDEN PROTEINE IN HEFEZELLEN 95
3.8.2. KOIMMUNOPRAEZIPITATION DER KLONE 39,115 UND 122 AUS HEFEZELLEN 96
3.8.3. IN V/FRO-EXPRESSION MIT ANSCHLIESSENDER KOIMMUNOPRAEZIPITATION 97
3.9. ISOLIERUNG VON PEX1 UND PEX6 PROTEINKOMPLEXEN 100
3.9.1. VORBEREITUNGEN FUER DIE *TANDEM AFFINITY PURIFICATION 100
3.9.2. EXPRESSION DER PEX1
- UND PEX6-FUSIONSPROTEINE 101
3.9.3. HEK293T-ZELLEN EXPRIMIEREN DIE PEX1- UND PEX6-FUSIONSPROTEINE 104
3.9.4. KOMPLEXISOLATION DER FUSIONSPROTEINE MIT DIGITONIN 106
3.9.5. KOMPLEXISOLATION MIT DER *TANDERN AFFINITY PURIFICATION -METHODE
109
3.9.6. PEX6-KOMPLEXISOLATION MIT DER *TANDERN AFFINITY
PURIFICATION -METHODE 111
3.9.7. PEX1 ALS BESTANDTEIL DES PEX6-PROTEINKOMPLEXES 113
3.9.8. IMMUNODETEKTION WEITERER PEROXINE IM PEX6-PROTEINKOMPLEX 114
3.9.9. PEX1-KOMPLEXISOLATION MIT DER *TANDEM AFFINITY
PURIFICATION -METHODE 116
3.9.10. AUSSCHLUSSCHROMATOGRAPHIE DES PEX6-PROTEINKOMPLEXES 117
3.9.11. ANALYSE DER PEX6-KOMPLEXGROESSE 119
3.9.12. PEX1 WAR BESTANDTEIL DES PEX6-KOMPLEXES 120
3.9.13. WEITERE PROTEINE WAREN BESTANDTEILE DER PEX6-KOMPLEXE 121
GLIEDERUNG V
3.10. MASSENSPEKTROMETRISCHE ANALYSE DER PEX6-PROTEINKOMPLEXE 123
3.10.1. ANALYSE DER PEX6-BINDUNGSPARTNER 128
3.10.2. PEX6 ALS BESTANDTEIL EINES INTERAKTIONSNETZWERKES 130
4. DISKUSSION 133
4.1. BEDEUTUNG DER KONSERVIERTEN DOMAENEN VON PEX1 UND PEX6 134
4.2. BETEILIGUNG DER PEROXINE PEX1, PEX6 UND PEX26 AM PEXS-EXPORT 136
4.3. PEX1 IST AN DER UBIQUITINYLIERUNG VON PEX5 BETEILIGT 138
4.4. DAS ZUSAMMENSPIEL VON PEX6 MIT POTENTIELLEN INTERAKTIONSPARTNERN
140
4.4.1. PEX1 ALS PEX6-LNTERAKTIONSPARTNER 140
4.4.2. INTERAKTION VON PEX6
MIT PROTEINEN DES CYTOSKELETTS 141
4.4.3. PEX6 UND
MITGLIEDER DER AAA-PROTEIN-FAMILIE 142
4.4.4. STOMATIN-LIKE 2 - EIN VIELVERSPRECHENDER KANDIDAT 145
4.5. VERGLEICH DER PEX6-BINDUNGSPARTNER MIT EINER PROTEOMANALYSE 146
4.6. GEGENUEBERSTELLUNG DER PEX6- UND PEX1-INTERAKTIONSPARTNER 147
4.7. PEX6-STRUKTUR UND -FUNKTIONSBEREICHE 150
4.8. ZELLULAERE FUNKTION VON PEX6 151
5. ZUSAMMENFASSUNG 154
6. LITERATUR 156
7. ANHANG 174
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